estabelecimento e multiplicação in vitro de ENDRO (Anethum graveolens L.)
SANTOS, Lívia Scheunemann1, RIBEIRO, Márcia Vaz1, LIMA, Cláudia Simone Madruga1, TURCHETTO, Andreia Carina1, PETERS, José Antônio1 e BRAGA, Eugenia Jacira Bolacel1.

1Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas – Departamento de Botânica – IB/UFPel;
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900. marciavribeiro@hotmail.com

1.	INTRODUÇÃO

O uso de plantas medicinais vem crescendo  a cada ano e as informações sobre o cultivo destas  para fins comerciais ainda são escassas [10]. Entretanto, existe uma preocupação crescente com respeito à conservação de recursos genéticos de  plantas medicinais, principalmente pelo fato das áreas devastadas crescerem em velocidade muito mais acelerada [2, 5].
A família Apiaceae é caracterizada predominantemente por ervas aromáticas, de pequeno a grande porte. Anethum graveolens L., também conhecido como endro, é amplamente utilizado na indústria de perfumes e na culinária devido ao seu aroma e sabor delicado. Na medicina popular é utilizado por suas propriedades anti-sépticas, estimulantes e digestivas [4, 6]. Essas características são atribuídas particularmente aos óleos essenciais presentes em A. graveolens, em especial à cumarina, metabólito que pode ser encontrado em diferentes partes das plantas, tanto nas raízes como nas flores e frutos [12].
Espécies economicamente importantes ou com dificuldade de propagação se beneficiam da técnica de propagação vegetativa in vitro ou micropropagação. Por este método obtêm-se plantas com alta qualidade fitossanitária e uniformidade genética, características importantes também para espécies medicinais [11].
Este trabalho teve por objetivo determinar a melhor condição para desinfestação de sementes de A. graveolens e avaliar a ação de diferentes meios para multiplicação in vitro desta espécie.

2.	MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da Universidade Federal de Pelotas. Sementes comerciais não tratadas foram utilizadas como material vegetal.
As sementes foram primeiramente lavadas em água destilada estéril com duas gotas de detergente neutro, durante 15 minutos sob agitação mecânica. Em câmara de fluxo laminar foram imersas por 15 segundos em etanol 70% e lavados com água destilada. Na seqüência, as sementes foram submetidas a três períodos de exposição ao agente desinfestante (15, 20 e 30 minutos), combinados com três concentrações de hipoclorito de sódio (1%, 1,5% e 2%). Posteriormente foram lavadas em água destilada estéril, secas em papel filtro e inoculadas em meio de cultura básico MS [8], sem a presença de reguladores de crescimento. Metade dos frascos foi colocado diretamente em sala de crescimento a 25±2°C, 16 horas de fotoperíodo e 48 µmol m-2 s-1 de fluxo de fótons, enquanto a outra metade foi mantida em câmara  escura, na mesma temperatura, sendo avaliados após 20 dias a porcentagem de contaminação e de germinação das sementes desinfestadas.
Os explantes com melhor aspecto foram transferidos para meio MS, a fim de eliminar resíduos da desinfestação, onde permaneceram durante 30 dias em sala de crescimento com condições controladas de temperatura e luz, conforme descrito anteriormente.
Segmentos nodais com aproximadamente 0,5 cm de A. graveolens cultivados in vitro, foram transferidos para meio de cultura MS utilizando quatro concentrações de cinetina (0; 1,0; 2,0 e 3,0 mg L-1) e duas concentrações de sacarose (3 e 6%), totalizando oito tratamentos.
O pH foi então ajustado para 5,8 antes da inclusão do ágar, na concentração de 7 g L-1. Posteriormente o meio foi autoclavado a 121 ºC e 1,5 atm por 20 minutos. Ao final de 30 dias foi feita a avaliação do número de brotações formadas e da altura das plantas.
O delineamento experimental utilizado para o experimento de desinfestação foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 3x3x2 enquanto o de multiplicação foi representado por um fatorial 4x2. Ambos os experimentos foram compostos por cinco repetições contendo cinco sementes e cinco explantes, respectivamente. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

   Após 20 dias do período de estabelecimento in vitro foi determinada a porcentagem de contaminação e germinação das sementes. Observou–se que todos os tratamentos foram eficientes para desinfestação, pois 100% dos frascos não apresentaram contaminação.
No que se refere a variável germinação verificou-se diferença estatística significativa apenas para o fator hipoclorito, onde a maior média foi de 64,7% de sementes germinadas na concentração de 1% de hipoclorito (Tabela 1). Foi observada diminuição da germinação conforme o aumento da concentração e/ou tempo de exposição ao hipoclorito, conforme observado por NASSI et al. [9] em estudos com sementes de bardana (Arctium lappa L.), os quais verificaram que a germinação in vitro foi afetada por altas concentrações de hipoclorito.

Tabela 1. Porcentagem de sementes germinadas de A. graveolens submetidas à desinfestação com diferentes concentrações de hipoclorito 

Concentração de hipoclorito (%)	Germinação (%)	
1,0	64,7 a	
1,5	    50,3   ab	
2,0	       44,7       b	
* Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey.

Foi observada, para a variável altura das plantas, que tanto as concentrações de cinetina e sacarose, exerceram efeito sobre a média encontrada (Tabela 2). MODGIL et al. [7] verificaram maior formação de brotos em maçãs estabelecidas em meios acrescidos de cinetina, corroborando os efeitos na divisão celular de plantas in vitro [13].

Tabela 2. Altura média (cm) das plantas de A. graveolens submetidas a diferentes concentrações de cinetina e sacarose durante 20 dias em meio MS

Cinetina (mg L-1)	 Concentrações de Sacarose 	
	3%	6%	
0	2,32	  ab A	2,43	   b A	
1,0	2,02	     bA	2,13	   b A	
2,0	1,62	     b   B	3,16	a    A	
3,0	2,72	a        B	3,80	a    A	
* Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não diferem estatisticamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey.

Na análise do número de brotos por explante, somente as concentrações de cinetina mostraram diferença estatística significativa, sendo que a maior média (1,58) foi encontrada na presença de 2,0 mg L-1, não diferindo das concentrações 1,0 e 3,0 mg L-1 (Tabela 3). Estes dados assemelham-se aos apresentados por Karunaratne et al. [3], os quais verificaram que a adição de BAP (benzilaminopurina) e cinetina no meio de cultura estimulou a produção de brotos em Cocos nucifera L.

Tabela 3. Média do número de brotos dos explantes de A. graveolens submetidas a diferentes tratamentos durante 20 dias em meio MS.

Cinetina (mg L-1)	Número de brotos	
0	                        1,09      b 	
1,0	                        1,15   ab	
2,0	                        1,58 a	
3,0	                        1,18   ab	
* Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey.
 
4. CONCLUSÕES

A desinfestação com 1% de hipoclorito é eficiente para evitar o aparecimento de agentes contaminantes em A. graveolens. Plantas com maior altura são obtidas utilizando altas doses de sacarose e de cinetina no meio de cultura, enquanto para se obter maior formação de brotos deve-se apenas considerar a adição de cinetina.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] Bhattacharyya R, Bhattacharya S. High frequency in vitro propagation of Phyllanthus amarus Schum. & Thom. by shoot tip culture. Indian J Exp Biol. 2001, v. 39(11), p.1184-1187.
[2] GOTTLIEB O. R.; MORS, W.B, Potencial utilization of brazilian wood extractives. J. Agric. Food. Chem. 1980, v.28, p.196-215.
[3] Karunaratne, S.; Periyapperuma k. Culture of immature embryos of coconut, Cocos nucifera L: Callus proliferation and somatic embryogenesis. Plant Science, 1989, v.62, p. 247-253.
[4] LEUNG, A.Y. Encyclopedia of common natural ingredients used in food, drugs and cosmetic. New York – Chichester: Wiley, 1980.
[5] LOYD, B. F.:JACKSON., M., Vegetables industrial crops, medicinal and foge planls. In: Plant Genetic Resource: An Introdution to their Conservation and use. Edward Arnold Ltda (ed), p.108-115, 1986.
[6] Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 29th edition. (Reynolds, JEF, editor). London: The pharmaceutical Press, 1993.
[7] Modgil, M., Sharma D. R, Bhardwaj, S. V. Micropropagtion of apple cv. Tydeman's Early Worcester. Scientia Horticulturae, v. 81, Issue 2 , 1, p. 179-188, 1999, 
[8] Murashige, T.; Skoog. F. Physiol. Plant., v.15, p. 473-497,1962. 
[9] NASSI, F. L. ; TURCHETTO, Andreia ; COMIOTO, Andressa ; ZANANDREA, Ilisandra ; PETERS, José Antônio ; BRAGA, Eugênia Jacira B . Desinfestação e Germinação in vitro de Bardana (Arctium lappa). Anais...: XIV Congresso Brasileiro de Sementes, 2005, Foz do iguaçu, 2005.
[10] NEWALL, C.A.; ANDERSON, L.A.; PHILLIPSON, J.D. Fitoterapia – Plantas Medicinais: Guia para Profissionais da Saúde. Ed. Premier. São Paulo, 2002.
[11] PAIVA, P. D. de O. Estabelecimento in vitro de estrelícia (Strelitzia reginae Ait.) e controle de oxidação com identificação dos compostos liberados no meio de cultura. 1998. 84 p. Tese (Doutorado em Fitotecnia) – Universidade Federal de Lavras,1998.
[12] RIBEIRO, Claudia Valeria Campos and KAPLAN, Maria Auxiliadora Coelho. Evolutionary tendency of coumarin-bearing families in angiospermae. Quím. Nova, v..25, nº.4, p.533-538. ISSN 0100-4042, 2002.
[13] TAIZ, L., ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 3ª edição. Editora Artmed. Porto Alegre, 2004.