PRESENÇA DE ANORMALIDADES NUCLEARES ERITROCITÁRIAS (ANEs) EM PINGÜINS-DE-MAGALHÃES (Spheniscus magellanicus) SUBMETIDOS A ESTRESSE

Rocha1, Alessandra Martins; Bobrowski1*, Vera Lucia; Meirelles Leite2, Alice; Silva Filho2, Rodolfo;  Adornes, Andreia C. 2 ;Vianna1, Rita Aloma Packeiser.; Rocha1, Beatriz Helena G. 

1Universidade Federal de Pelotas, IB, Depto. de Zoologia e Genética, C.P.354, CEP 96010-970, Pelotas, RS, Brasil 
2 Fundação Universidade Federal do Rio Grande, Museu Oceanográfico “Prof. Eliézer de C. Rios”, Centro de Recuperação de Animais Marinhos, Rio Grande, RS, Brasil.   

1. INTRODUÇÃO

Os pingüins são aves marinhas da família Spheniscidae amplamente distribuídas nas águas frias, temperadas e quentes do hemisfério Sul. Apesar de ser um símbolo antártico, somente 3 das 17 espécies de pingüins conhecidas habitam esse continente. As colônias de Pingüins-de-Magalhães (Spheniscus magellanicus) mais próximas do Brasil estão na costa Patagônica. Após a época de reprodução, que vai de setembro a março, os exemplares adultos e juvenis deixam as colônias e começam a migrar em direção ao Norte acompanhando o deslocamento de correntes marítimas, provavelmente em busca de alimento [1] [2]. 
As populações de Pingüins-de-Magalhães vêm declinando ao longo dos anos, principalmente em função de fenômenos climáticos, da intensidade da pesca comercial, da poluição crônica das águas por óleo e derivados, e do turismo praticado nas colônias reprodutivas destes animais [1] [3]. Segundo Gandini et al. [3], a poluição crônica por óleo é um dos fatores responsáveis pela mortalidade de Pingüins-de-Magalhães adultos ao longo da costa Argentina, podendo acarretar declínio populacional. 
No Brasil é freqüente a ocorrência de exemplares de Pingüins-de-Magalhães, juvenis e adultos nas praias, geralmente em função de fraqueza, enfermidades, separação do grupo e contaminação por óleo [4]. Estes animais são encaminhados ao Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM), localizado junto ao Museu Oceanográfico “Prof. Eliézer de C. Rios”, para reabilitação. 
	 Deste modo, é importante monitorar a ação genotóxica e/ou citotóxica do petróleo e seus derivados, que ao longo do tempo poderia contribuir para acelerar o declínio populacional desta espécie. 
O teste de Micronúcleo (MN) em eritrócitos presentes no sangue periférico é um dos mais aceitos e validados internacionalmente, pois é de baixo custo, rápido e permite a visualização não só de micronúcleos como de outras anormalidades nucleares eritrocitárias, as quais são demonstrativas de genotoxicidade [5]. Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo avaliar a presença de anormalidades nucleares eritrocitárias (ANEs) através do teste de micronúcleos em Pingüins-de-Magalhães expostos a estresse por contaminação alimentar ou pelo  petróleo, antes e após o período de recuperação.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

O estudo foi realizado em lâminas de esfregaço sangüíneo de Pingüins-de-Magalhães encaminhados ao CRAM, que chegaram ao litoral sul do Rio Grande do Sul debilitados e por vezes cobertos de óleo. Foram realizadas duas coletas de sangue periférico, uma na chegada do animal e outra após sua reabilitação. As amostras de sangue periférico de 18 animais foram colhidas da veia metatarsal medial com agulha 25x7 [4]. Logo após a coleta foram confeccionados dois esfregaços sangüíneos de cada animal pelo método padrão, os quais foram secos à temperatura ambiente por 24 horas e fixados com metanol durante 15 minutos. O material foi conduzido ao Laboratório de Genética da UFPel e corado com Giemsa [6]. Em microscópio Olympus com objetiva de 100X foram analisados 5000 eritrócitos por indivíduo (2500 eritrócitos por lâmina).
A avaliação citogenética foi efetuada em teste cego, no qual foram observadas anormalidades como micronúcleos, núcleos ligados, células binucleadas e núcleos com brotamentos. A análise estatística foi realizada utilizando-se o pacote estatístico SPSS, “10.0 for Windows” e as médias comparadas pelo teste t (p<0,05). 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

	Os pingüins recém chegados ao CRAM encontravam-se desnutridos e por vezes cobertos de óleo (Fig 1A). Uma vez reabilitados, em grupos esperaram a época do ano correta para serem devolvidos ao habitat natural em perfeito estado de saúde (Fig 1B).
As médias obtidas para presença de micronúcleos (Fig 1C, seta), células com núcleos ligados e com brotamentos (Fig 1D, seta) não mostraram diferença estatisticamente significativa entre as coletas realizadas na recepção dos animais no CRAM e na liberação destes animais após o período de reabilitação  (p > 0,05) (Tab 1).

Figura 1. Pingüins-de-Magalhães encaminhados ao CRAM. A. Animais petrolizados recém chegados ao local. B. Animais limpos prontos para liberação. C. Células com micronúcleo. D. Célula com brotamento.

De acordo com os resultados mostrados na tabela 1 podemos verificar um número elevado de anormalidades nucleares eritrocitárias (Fig 1D) do tipo brotamento, o qual não diminuiu após período de  reabilitação. Estas estruturas são ligadas ao núcleo principal da célula por um fio ou haste de cromatina [7]. De acordo com Serrano-Garcia & Montero-Montoya [7] estas estruturas  foram observadas em inúmeros tipos de células, como as de sangue e mucosa, e estão correlacionadas ao processo de formação/estruturação dos micronúcleos estimulado pela ação de agentes genotóxicos. Esta observação torna-se preocupante pois esta espécie apresenta um declínio populacional crescente vinculado ao impacto ambiental e à destruição de seu habitat.

Tabela 1. Avaliação das anormalidades nucleares eritrocitárias (ANEs) em sangue periférico de Pingüim-de-Magalhães antes e após período de reabilitação.
  
ANEs	Número de indivíduos analisados	Período de recuperação	Média	
Células com micronúcleos 	18	Entrada	1,22  1,44	
	18	Liberação	1,72  1,87 	
Células com brotamentos 	18	Entrada	7,33  6,92	
	18	Liberação	8,89  5,20 	
Células com núcleos ligados	18	Entrada	0,67  1,24 	
	18	Liberação	0,22  0,55	

A ação de agentes mutagênicos como o petróleo, pode ser responsável pela origem das aberrações cromossômicas estruturais e numéricas, tanto em células somáticas, podendo levar a formação de um tecido neoplásico, como em células germinativas, gerando síndromes e/ou anomalias congênitas nos futuros conceptos desses pingüins, cujas fêmeas fazem a postura de um só ovo por ano, sendo dessa forma de reprodução lenta e muito vulnerável. Por outro lado, deve-se considerar que o estresse físico e nutricional sofrido não somente em decorrência da petrolização como também da exaustiva trajetória até a costa brasileira, também pode levar a um estresse oxidativo nas células destes animais e, portanto, possibilitar o aparecimento destas anormalidades. Resultados semelhantes foram obtidos em sangue periférico humano quando estes eram submetidos a uma dieta de baixas calorias e exercícios físicos [8].

4. CONCLUSÃO  

	Devido aos índices de anormalidades nucleares eritrocitárias do tipo brotamentos observados, os Pingüins-de-Magalhães devem ser biomonitorados para que se estabeleça uma eventual relação entre estes eventos e o declínio da população. 

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 [1] WILLIAMS, T.D. 1995. The pengüins. Oxford: Oxford University Press, p. 1-258 
 [2] SICK, Helmut. 1997. Ornitologia Brasileira. Rio de Janeiro: Nova Fronteira, 912 pp.
 [3] GANDINI, P.; BOERSMA, P.D.; FRERE, E.; GANDINI, M.; HOLIK, T.; Lichtschein, V. 1994 Magellanic Pengüins (Spheniscus magellanicus) affected by chronic petroleum pollution along coast of Chubut, Argentina. The Auk, 111 (1): 20-27. 
[4] RUOPPOLO, V.; ADORNES, A. C.; NASCIMENTO, A. C.; SILVA FILHO, R. P. 2004. Reabilitação de pingüins afetados por petróleo. Clínica Veterinária, ano IX, n. 51, 78-83.
[5] RABELLO-GAY, M.N. Mutagênese, Teratogênese e Carcinogênese: métodos e critérios de avaliação, Ribeirão Preto, SP : Ed. SBG, 1991. 241p.
[6] SERRANO-GARCIA, L.; MONTERO-MONTOYA, R. 2001. Micronuclei and chromatid buds are result of related genotoxic events. Environ. Mol. Mutagen., v.38, n.1, 38-45.
[7] MORIMOTO, K.; TAKESHITA,T.; TAKE-UCHI, T.; MARUYAMA, S.; EZOE, S.; MURE,K; INOUE, C. 1993. Chromosome alterations in peripherical lymphocytes as indices os lifestyle and genotoxicity. Intern. Arch. Occup. Environ. Health, v.65, n.1, S37-S41.