AMPLIFICAÇÃO POR PCR DO GENE fimA DE Salmonella Typhimurium CAPTURADA ATRAVÉS DE SEPARAÇÃO IMUNOMAGNÉTICA 

MOREIRA, Ângela Nunes 1, 2; CONCEIÇÃO, Fabricio Rochedo3; CONCEIÇÃO, RITA de Cássia dos Santos 4; DIAS, Clarice Nunes 1, 2; DELLAGOSTIN, Odir Antonio 5; CARVALHAL, José Beiro 2; ALEIXO, José Antonio Guimarães 1, 2

1Laboratório de Imunologia Aplicada - Centro de Biotecnologia/UFPel
2Laboratório de Análises de Alimentos - Faculdade de Nutrição/UFPel
3Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária - Faculdade de Medicina Veterinária/ UFPel 
4Laboratório de Inspeção de Leite - Faculdade de Medicina Veterinária/ UFPel
5Laboratório de Biologia Molecular - Centro de Biotecnologia/UFPel
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1.	INTRODUÇÃO

	Salmonella Typhimurium é um dos principais microrganismos causadores de toxinfecções alimentares e de surtos de infecções por salmonelas multi-droga resistentes (SMDR). O método convencional para detecção e isolamento de salmonelas em alimentos é trabalhoso e geralmente requer 5 a 7 dias para obtenção de resultados. Por isso, vários métodos rápidos têm sido desenvolvidos. Entretanto, muitos métodos rápidos disponíveis para a detecção de patógenos em alimentos não apresentam boa sensibilidade e especificidade, são muito complexos, requerem equipamentos e reagentes de custo elevados ou alto nível de habilidade técnica para serem executados [3]. Além disso, poucas tentativas têm sido feitas para desenvolver métodos rápidos para detecção específica de Salmonella Typhimurium.
	A amplificação de DNA in vitro através da reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma ótima alternativa para detecção rápida, sensível e específica de bactérias patogênicas em alimentos. A especificidade de uma PCR depende da fidelidade dos primers utilizados. Por isso, é necessário utilizar seqüências de primers que sejam únicas para o patógeno alvo. Já a sensibilidade depende das condições da reação, da pureza do DNA e da presença de substâncias inibitórias. Por isso, é necessário remover componentes inibitórios associados aos alimentos, separar e concentrar os microrganismos da amostra e purificar o DNA destes [2]. 
	A separação imunomagnética (IMS) é uma técnica de separação e concentração de microrganismos simples, sensível e acessível que tem sido aplicada para reduzir o tempo de isolamento e detecção. A IMS usa partículas de látex magnetizadas, cobertas com anticorpos poli ou monoclonais, para remoção dos microrganismos de culturas líquidas através de um magneto [8]. No caso das salmonelas, a técnica tem sido usada para separá-las de outras enterobactérias antes de fazer o plaqueamento em ágar seletivo, para substituir o passo de enriquecimento seletivo [7], associada à ELISA [6] ou PCR [5]. A utilização da IMS aumenta a sensibilidade  da PCR, pois concentra as células alvo e as separa dos inibidores da reação e da microflora competitiva [10].  
	O objetivo desse trabalho foi desenvolver um método de detecção baseado na amplificação por PCR do gene fimA de Salmonella Typhimurium capturada através de IMS utilizando microesferas magnéticas sensibilizadas com um anticorpo monoclonal.

2.	MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Cepas bacterianas, condições de cultivo e extração de DNA 
	Salmonella Typhimurium foi obtida da coleção de culturas da FIOCRUZ-RJ, mantida liofilizada e cultivada em caldo infusão de cérebro e coração (BHI) por 16-18 h a 37o C. Contagens foram feitas em placas com agar padrão de contagem em placas (PCA). A extração de DNA das bactérias foi feita através da adição de 20 mL de solução 0,125% SDS, 0,05M NaOH (1:1) e aquecimento da mistura a 95o C por 15 min.

2.2 Microesferas magnéticas cobertas com MAb anti-Salmonella Typhimurium
As microesferas magnéticas utilizadas neste trabalho são de poliestireno, cobertas com proteína A, com 0,86 mm de diâmetro e suspensas a 1% de sólidos. Estas foram sensibilizadas com o MAb de acordo com recomendações de Conceição [1]. O MAb utilizado na sensibilização foi produzido em nosso laboratório de acordo com as recomendações de Harlow & Lane [4], é do isotipo IgG2b e específico para uma preparação de proteínas de membrana externa (OMP) de Salmonella Typhimurium. 

2.3 Primers utilizados na PCR
	Os primers utilizados nesse trabalho foram desenhados em nosso laboratório com o auxílio do software Vector-NTI e sintetizados por MWG-Biotech usando um sintetizador de DNA automático. O produto esperado é um fragmento de 566 pb, correspondente a todo o gene fimA de Salmonella Enteritidis (número de acesso no Genbank S76043). Os primers foram testados em uma PCR com DNAs extraídos de salmonelas de todos sorogrupos e com de outras bactérias e se mostraram altamente específicos. A seqüência do primer forward é 5’ GGG GGA TCC ATG AAA CAT AAA TTA ATG ACC 3’ e a do primer reverse é 5’ CCG AAT TCT CAC ATG ATA AAG GTG GCG 3’.  

2.4 Recuperação de Salmonella Typhimurium a partir de amostras de alimentos experimentalmente contaminados 
	Para verificar se a flora natural dos alimentos afeta o desempenho do teste, amostras de 25 g de carne bovina e de frango foram experimentalmente contaminadas com 1-10, 10-102 e 102-103 células de Salmonella Typhimurium. Foram testados três protocolos de enriquecimento para detecção das salmonelas em cada nível de contaminação. O primeiro consistiu de um pré-enriquecimento de 16-18 h em água peptonada tamponada (BPW) a 37º C antes da IMS e PCR; o segundo, foi semelhante ao primeiro, mas apresentou um pós-enriquecimento de 6 h em caldo BHI após a IMS e o terceiro, consistiu de um pré-enriquecimento de 6-8 h em BPW e um pós-enriquecimento de 16-18 h em caldo BHI a 37º C, respectivamente, antes e após a IMS. A IMS foi realizada com 20 mL de microesferas sensibilizadas. Para controle da IMS as salmonelas ligadas às microesferas foram semeadas em agar xilose lisina desoxicolato (XLD) para observação de colônias típicas após incubação a 37o C por 24 hs. Um microlitro de DNA extraído foi utilizado na amplificação por PCR. Todas as amostras foram analisadas também através da metodologia convencional de detecção de salmonelas. Contagens foram realizadas para confirmar o número de células adicionadas às amostras. 

2.5 PCR
	A reação de PCR de 25 mL consistiu de: 25 rmol de cada primer; 1,5 mM de MgCl2; 0,2 mM de cada dNTP; 1 U de Taq DNA polimerase recombinante, 1X tampão de PCR e 1mL de DNA. A amplificação ocorreu em termociclador utilizando o seguinte programa: temperatura inicial de desnaturação de 95oC por 5 min, 30 ciclos de desnaturação por 30 s a 95oC, anelamento por 30 s a 60oC, extensão por 30 s a 72oC e extensão final de 7 min a 72oC. O produto da PCR foi analisado através de eletroforese em gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio. 

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

	Salmonella Typhimurium foi capturada e concentrada pela IMS utilizando microesferas magnéticas cobertas com o MAb e detectada através da amplificação do gene fimA. Um fragmento de aproximadamente 566 pb foi amplificado a partir do DNA de todas as amostras de carne bovina testadas e de amostras de carne de frango contendo 10 a 102 e 102 a 103 células de Salmonella Typhimurium por 25 g (Figura 1). Salmonella Typhimurium foi detectada em todas as amostras através da metodologia convencional.

Figura 1. Recuperação de Salmonella Typhimurium a partir de amostras de alimentos experimentalmente contaminados através de IMS-PCR. (a) Eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR utilizando os DNAs extraídos das salmonelas capturadas da carne bovina; (b) da carne de frango. Linhas: 1, marcador de peso molecular; 2, controle positivo; 3, controle negativo; 4, amostra contaminada com 1 a 10 UFC/mL, 1º protocolo de enriquecimento (PE); 5, 10 a 102 UFC/mL, 1º PE; 6, 102 a 103 UFC/mL, 1º PE; 7, 1 a 10 UFC/mL, 2º PE; 8, 10 a 102 UFC/mL, 2º PE; 9, 102 a 103 UFC/mL, 2º PE; 10, 1 a 10 UFC/mL, 3º PE; 11, 10 a 102 UFC/mL, 3º PE; 12, 102 a 103 UFC/mL, 3º PE. O 1º PE consistiu de um pré-enriquecimento de 16-18 h em BPW a 37º C antes da IMS e PCR; o 2º foi semelhante ao primeiro, mas apresentou um pós-enriquecimento de 6 h em caldo BHI após a IMS e o 3º consistiu de um pré-enriquecimento de 6-8 h em BPW e um pós-enriquecimento de 16-18 h em caldo BHI a 37º C, respectivamente, antes e após a IMS.

	Entre os protocolos testados, o que apresentou bandas mais nítidas e consequentemente os melhores resultados foi o segundo, que incluiu um pré-enriquecimento de 18 h em água peptonada tamponada, IMS, pós-enriquecimento de 6 h em caldo BHI e PCR. Trkov et al [11] também detectaram 100 UFC de Salmonella Enteritidis em 25 g de alimento experimentalmente contaminado. Eles utilizaram um protocolo de enriquecimento que incluiu um pré-enriquecimento de 6-8 h, IMS, enriquecimento seletivo de 16-18 h e PCR. Este foi semelhante ao terceiro protocolo do presente trabalho, com exceção do enriquecimento seletivo após a IMS que neste protocolo foi substituído por um pós-enriquecimento não-seletivo em BHI. A seletividade do protocolo do presente trabalho foi dada pela utilização do MAb anti-Salmonella Typhimurium, altamente específico, adsorvido às microesferas utilizadas na IMS. Rijpens et al [9] também detectaram 5,9 UFC de salmonelas em 25 g de produtos lácteos e derivados de ovos após pré-enriquecimento de 16 h, IMS, pós-enriquecimento de 4 h e PCR. O tempo total do teste desenvolvido no presente trabalho foi de aproximadamente 27 h.

4. CONCLUSÕES

	O método de detecção baseado na amplificação por PCR do gene fimA de Salmonella Typhimurium capturada através de IMS utilizando microesferas magnéticas sensibilizadas com um anticorpo monoclonal apresentou boa sensibilidade e especificidade e potencial para ser utilizado na detecção desta bactéria em alimentos. 

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1]	CONCEIÇÃO, R.C.S. Detecção de Salmonella em produtos de frango usando a separação imunomagnética. Dissertação de mestrado, DCTA-UFPel, 2004.
[2]	de BOER, E.; BEUMER, R.R. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. International Journal of Food Microbiology, 1999, v.50, p.119-130.
[3]	FAVRIN, S.J.; JASSIM, S.A.; GRIFFITHS, M.W. Application of a novel immunomagnetic separation-bacteriophage assay for the detection of Salmonella enteritidis and Escherichia coli O157:H7 in food. International Journal of Food Microbiology, 2003, v. 85, p. 63-71.
[4]	HARLOW, E.; LANE, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1988, p. 726.
[5]	HSIH, H.Y.; TSEN, H.Y. Combination of immunomagnetic separation and polymerase chain reaction for the simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella spp. in food samples.  Journal of Food Protection, 2001, v. 64, n.11, p. 1744-1750.
[6]	MANSFIELD L.P., FORSYTHE S.J. The detection of Salmonella serovars from animal feed and raw chicken using a combined immunomagnetic separation and ELISA method. Food Microbiology, 2001, v.18, p. 361-366.
[7]	MANSFIELD, L.; FORSYTHE, S. Collaborative ring-trial of Dynabeads anti-Salmonella for immunomagnetic separation of stressed Salmonella cells from herbs and spices. International Journal of Food Microbiology, 1996, v. 29, n.1, p. 41-47.
[8]	OLSVIK, O.; POPOVIC, T.; SKJERVE, E.; CUDJOE, K.S.; HOMES, E.; UGELSTAD, J.; UHLEN, M. Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology. Clinical Microbiology Review, 1994, v. 7, p. 43-54.
[9]	RIJPENS, N.; HERMAN, L.; VERECCKEN, F.; JANNES, G.; DE SMEDT, J.; DE ZUTTER, L. Rapid detection of stressed Salmonella spp. in dairy and egg products using immunomagnetic separation and PCR. International Journal of Food Microbiology, 1999, v.46, n.1, p.37-44.
[10]	 SPANOVÁ, A; RITTICH, B.; HORÁK, D.; LENFELD, J., PRODELALOVÁ, J.; SUCIKOVÁ, J.; STRUMCOVÁ, S. Immunomagnetic separation and detection of Salmonella cells using newly designed carriers. Journal of Chromatography A, 2003, v.1009, p. 215-221.
[11]	 TRKOV, M.; MAJERIKOVA, I.; JERASEK, B.; STEFANOVICOVA, A.; RIJPENS, N.; KUCHTA, T. Detection of Salmonella in food over 30 h using enrichment and polymerase chain reaction. Food Microbiology, 1999, v.16, n.4, p.393-399.