AVALIAÇÃO CITOTÓXICA DE FORMOL E HIPOCLORITO DE SÓDIO UTILIZADOS NA DESINFESTAÇÃO DE SEMENTES EM CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS.

BORGES, Clarissa de Souza1*; CATTELAN, Letícia Vesz1; VARGAS, Daiane Peixoto1; BOBROWSKI, Vera Lucia1

1Laboratório de Genética – DZG – IB - UFPel
Campus Universitário s/n, Caixa Postal 354 - CEP 96010-970, Pelotas, RS
* e-mail: cborges_ib@ufpel.edu.br

1. INTRODUÇÃO

Várias espécies são utilizadas em cultura de tecidos vegetais, de acordo com sua importância econômica, agronômica, medicinal ou ornamental, usando para isso diferentes tecidos como: sementes, folhas, meristemas entre outros.  
Dentre as diferentes técnicas de cultura de tecidos, a micropropagação ou clonagem in vitro tem sido a mais aplicada, pois oferece inúmeras vantagens tais como: rápido aumento do número de plantas geneticamente idênticas, produção de mudas o ano todo e plantas com alta qualidade sanitária, além disso, pode auxiliar na propagação de plantas a partir de sementes que possuem baixo poder germinativo [12] [11].
Um dos pontos cruciais da cultura de tecidos é a instalação da planta in vitro livre de patógenos para sua melhor sobrevivência e crescimento, assim é necessário determinar as condições de desinfestação adequadas para garantir um ambiente asséptico sem danificar os explantes [13].
O método de desinfestação de sementes é ferramenta básica e essencial para o estabelecimento in vitro de uma cultura. O uso de hipoclorito de sódio ou cálcio, mercúrio ou pastilhas de formol, pode interferir na qualidade fisiológica da semente dependendo da concentração e do tempo de exposição a estas substâncias.
O formaldeído é um gás, normalmente utilizado em solução aquosa, incolor com odor penetrante e irritante. Possui inúmeras aplicações como, por exemplo, na preservação de cadáveres, em produtos de limpeza, como composto na produção industrial e como esterilizante. Os efeitos tóxicos deste composto são relatado em seres humanos e animais [7].
O aldeído fórmico atua como fixador interagindo com os aminoácidos lisina e arginina. Tal fixador não provoca precipitação de proteínas, não preserva gorduras livres, porém fixa lipídeos complexos, provoca leve precipitação de outros constituintes celulares e não é o fixador de eleição para carboidratos [7].
O hipoclorito de sódio é uma solução aquosa alcalina com 10% de cloro ativo e cerca de 10-13 g/l de soda residual, de coloração amarela e odor característico. É produzido pela reação entre o Cloro gás e uma solução de hidróxido de sódio [3]. Na desinfestação de sementes utiliza-se hipoclorito de sódio a 1% de cloro ativo ou mesmo produto contido em alvejantes domésticos, usados na concentração de 20% v/v que equivale a 1 – 1,5% do cloro ativo [13].
Estas substâncias utilizadas rotineiramente para desinfestação em cultura de tecidos podem interferir no processo de divisão celular e conseqüentemente no desenvolvimento de plantas normais. Deste modo, o teste citogenético pode auxiliar na avaliação do dano causado por estas substâncias.
 Portanto, a finalidade desta pesquisa foi de analisar o efeito do hipoclorito de sódio e do formaldeído sobre células meristemáticas de cebola (Allium cepa L.), como referência para aplicação destes compostos sobre material biológico utilizado em cultura de tecidos vegetal.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Para tanto, sementes de cebola foram previamente tratadas com hipoclorito de sódio em solução de 20% do produto comercial de uso doméstico (2,5% p.a.), sendo que as sementes permaneceram na solução por 10 minutos e 20 minutos. No tratamento com formol as sementes ficaram em recipiente hermeticamente lacrado com pastilha de formol (mas não em contato) por um período de 2 ou 4 horas. Após estes tratamentos a sementes foram colocadas em caixa tipo gerbox, com papel mata-borrão embebido em água destilada. As sementes foram colocadas em germinador com temperatura de 20º C conforme RAS (1992) [1].
As raízes de cebola, após 4 dias de germinação foram coletas e fixadas em fixador Carnoy (3:1) permanecendo em temperatura ambiente por até 24h. Após este período foram armazenadas em freezer para posterior análise microscópica. Para a confecção de lâminas, as pontas de raiz foram hidrolisadas em HCl 5N por 20 minutos e coradas com orceína acética 2%, segundo Guerra (2002) [5] para protocolos de lâminas provisórias.
As lâminas foram analisadas, pelo método de varredura, em microscopia óptica em dimensão de 500x, quatro repetições de 500 células/lâmina por variedade, um total de 2000 células por tratamento, assim como um controle (germinação em água destilada).
Para análise da variância foi utilizado o Sistema SANEST e o teste de Duncan para comparação das médias [14].  

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados mostrados na figura 1 indicam que houve diferença significativa entre os tratamentos e o controle. Porém, não houve diferença significativa entre si, ao nível de 5% de probabilidade, nos tratamentos com formol por 4 horas e o uso de hipoclorito de sódio por 10 e 20 minutos, respectivamente 5.2, 5.6 e 5.7%.  No entanto, os resultados apresentaram diferença estatística no tratamento com formol 2 horas com 30.2% de divisão celular em relação ao controle (57.8%).
Na análise citogenética observou-se a presença de quebra cromossômica e de micronúcleos, isto é, um núcleo adicional e separado do núcleo principal de uma célula, formado durante a divisão celular por cromossomos ou fragmentos de cromossomos que se atrasam em relação aos demais. Resulta de alterações estruturais cromossômicas espontâneas ou experimentalmente induzidas, ou ainda, de falhas no fuso celular [9]. Porém estes resultados não foram quantificados por não terem sido observados em numero significante de células.

Figura 1 Avaliação do Índice mitótico em células meristemáticas de cebola tratadas com: formol 2 e 4 horas, hipoclorito de sódio por 10 e 20 minutos.

Explantes ou sementes que serão utilizadas in vitro tem se mostrado um eficiente meio de disseminação de fungos e bactérias, pois trabalhos realizados com sementes de alecrim e manjericão evidenciaram a presença de mais de cinco gêneros de fungos em alecrim e 11 em manjericão [5] [8].
Portanto, a desinfestação é necessária mesmo que cause danos ao explante inicial como descreve Santos (2005) [10] onde o uso de hipoclorito de sódio promove queimaduras nos explantes de Cariocara brasiliense CAMB., mas também uma desinfestação eficiente. Para Kikuchi et al. (2001) [6] o uso de hipoclorito de sódio 2% por 10 ou 20 min causou a morte dos explantes de camu-camu. 
Segundo Fior et al. (2001) [4] o uso do paraformaldeido por 2h em Limonium platyphyllum Lincz. eliminou a contaminação por fungos porém interferiu na regeneração de brotações do material in vitro. 
Os efeitos avaliados através dos testes de toxicidade sobre a germinação e/ou desenvolvimento da planta de cebola (Allium test), indicam, muitas vezes, manifestações secundárias de efeitos ocorridos a nível molecular e celular causados pelos agentes químicos utilizados na desinfestação, estes efeitos podem ser revelados através dos testes citogenéticos como os observados neste trabalho.

4. CONCLUSÃO

Dentre os agentes de desinfestação testados neste trabalho e utilizados em cultura de tecidos, o uso do formol por duas horas causou menores danos genéticos ao explante inicial.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] BRASIL. Ministério da Agricultura e da Reforma Agrária. Regras para Análise de Sementes. Brasília: SNDA/DNDV/CLAV, 1992.365p. 
[2] CASARIN, J. V.; TIMM, F. C.; PIEROBOM, C. R.; ROSSETTO, E. A.; ROCHA, B. H. G. Microorganismos Associados a Sementes de Manjericão In: Anais do Congresso Sul-Riograndense de Biociências, 2003 (CD-rom).
[3] Cia. Agro Industrial Igarassu. Disponível em: <http://www.caii.com.br/ctudo-produtos-hipoclorito.html>  Acesso em: 27 ago. 2005.
[4] FIOR; C. S.; RODRIGUES, L. R.; KÄMPF, A.N. Assepsia com paraformaldeído no cultivo de discos foliares e segmentos nodais de Limonium platyphyllum Lincz In: Anais do IV Encuentro Latinoamericano de Biotecnologia Vegetal (CD-rom), n.01-089. 2001.
[5] GUERRA, M. e Souza, M. J. de. Como observar cromossomos - um guia de técnicas em citogenética vegetal, animal e humana. Ed. FUNPEC. Ribeirão preto-SP. 131p. 2002.
[6] KIKUCHI, T. Y. P.; NUNES, H. da C. B.; MOTA, M. G. da C.; VIEIRA, I. M.dos S; RIBEIRO, S. I.; CORRÊA, M. L. P. Assepsia para sementes de camu-camu (Myrciaria dubia (H.B.K) Mc vaugh) cultivadas in vitro In: Anais do IV Encuentro Latinoamericano de Biotecnologia Vegetal (CD-rom), n. 01-059, 2001.
[7] LAB&VET - Laboratório de análises clínicas e anatomia patológica veterinária. Disponível em: <http://www.labvet.com.br/html/home.htm> Acesso em: 27 ago. 2005.
[8] LIMA C. R.; PIEROBOM, C. R.; ROSSETTO, E. A.; ROCHA, B. H. G.; BOBROWSKI, V. L. Microorganismos em Sementes de Alecrim In: Anais do Congresso Sul-Riograndense de Biociências, 2003 (CD-rom).
[9] RAMIREZ, A. Análise de Células Metanucleadas de Alcoólicos Portadores de Carcinomas Orais. 2000. 126f. Dissertação (Mestrado em Biociências) – Universidade de São Paulo. 2000.
[10] SANTOS, B. R. et al. Controle da contaminação de explantes foliares e caulinares de pequizeiro ( Cariocar brasiliense CAMB), visando o estabelecimento in vitro. Horticultura Brasileira, v. 23, ago. 2005.
[11] SERAFINI, L. A.; BARROS, N. M. de; AZEVEDO, J. L. de. Biotecnologia na Agricultura e na Agroindústria. Guaíba RS: Ed. Agropecuária, 2001. 463 p.
[12] SINGH, N. K.; SEHGAL C. B. Micropropagation of  “Holy basil” (Ocimum sanctum L.  from young inflorescens of mature plantas. Plant Growth Regulation, 29: 161-166.1999.
[13] TORRES, A. C. et al. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Brasília: Embrapa, 2 v. (864p.):;il .1998.
[14] ZONTA, E. P.; MACHADO, A. A. SANEST – Sistema de análise estatística para microcomputadores. Pelotas, 1984.