Análise Da Variação Genética Entre Reprodutores E Progênie Selecionada De Oreochromis niloticus Estimada Com O Uso Do Marcador De Rapd
Iganci, J. R. V.1*; Moreira, H. L. M.2; Povh, J. A.3; Astolphi, J. L. L.3
1:Bolsista PIBIC CNPq, DZG/IB, Universidade Federal de Pelotas (joaoiganci@terra.com.br); 2:Professor Adjunto DZG/IB, Universidade Federal de Pelotas (heden@ufpel.edu.br).
3:Centro de Biotecnologia (CENBIOT)

Introdução

No Brasil, como em outros países, se tem verificado um decréscimo na produção pesqueira em função do declínio na captura, a qual tem sido insuficiente para atender a demanda interna. Além disso, o consumo “Per Capita” de pescados no Brasil é de 6,8 kg/ano, quando a Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda 13 kg/habitante/ano. Exemplos de países que investiram na produção de peixe como alternativa de desenvolvimento, gerando emprego e renda, são vistos em todo o mundo: a China maior produtor mundial em aquicultura produz cerca de 30 milhões de toneladas/ano, gerando uma receita de U$ 25 bilhões e 7 milhões de empregos. No Brasil estima-se uma produção anual ao redor de 60 mil toneladas/ano. Portanto, a produção da piscicultura brasileira representa menos de 10% da produção da pesca, que gira ao redor de 700 mil toneladas/ano, enquanto o consumo nacional está próximo de um milhão toneladas/ano. 
Com relação à espécie alvo para investigação foi escolhida a Tilápia (Cichlidae), que são nativas de águas tropicais da África e se adaptaram muito bem no Brasil. A Tilápia é a segunda espécie em importância na aquicultura mundial devido à qualidade de sua carne. 
Um requisito inicial para aplicação da seleção no melhoramento genético para aumento da produção é a existências da variabilidade, sendo o primeiro passo em um programa de melhoramento visando o desenvolvimento de uma linhagem. A segunda etapa envolve a identificação da associação entre marcadores de DNA e características fenotípicas, além do controle dos níveis de consangüinidade resultante do processo de seleção.
	Análises genéticas com os marcadores RAPD são relativamente fáceis, rápidas e eficientes. Este marcador tem sido usado para detecção da variação genética em espécies de peixes, para identificação de espécies e subespécies de peixe, para identificação de peixes ginogenéticos, em estudos filogenéticos e para mapeamento genético [6].
Embora a Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) seja uma espécie de peixe com enorme potencial no mundo e no Brasil, estudos de melhoramento genético nesta espécie via seleção ainda não foram realizados no Brasil. Com base no exposto, o presente trabalho teve como objetivos aplicar o marcador de RAPD para estimar a diversidade genética entre reprodutores de Tilápias e sua progênie, a qual foi selecionada para ganho de peso. Portanto, o trabalho buscou avaliar se ocorreu uma redução da variabilidade genética no material selecionado e se o marcador de RAPD seria adequado para esta avaliação.

Materiais e Métodos

 Para a extração de DNA genômico fragmentos de nadadeira caudal de aproximadamente 0,5 cm2, preservados em microtubo com etanol 70%, armazenados em freezer, foram colocados em tampão de lise e proteinase K por 12 horas em Banho-maria a 45ºC. Em seguida o DNA foi purificado com fenol-Tris pH 8,0 e clorofórmio. O DNA obtido foi precipitado com duas vezes e meia de etanol e um décimo de acetato de sódio ao volume recuperado, e ressuspendido em tampão TE, permanecendo incubado por uma hora sob refrigeração e, posteriormente, adicionado 5l de RNAse (10ng/ml). A qualidade e a quantidade de DNA extraído foi checada em agarose 0,7%, corada com brometo de etídio e analisada em luz ultravioleta. As reações de RAPD foram amplificadas em um termociclador Eppendorf, programado para 40 ciclos, com um passo inicial de desnaturação a 94 ºC por 4 min e um passo final de extensão a 72 ºC por 5 min. Cada ciclo consistiu de 1 min a 94 ºC, 1 min a 40 ºC e 2 min a 72 ºC. Uma reação controle negativo sem DNA foi realizada para cada conjunto de amplificação.
	Os produtos de amplificação foram separados em gel de acrilamida/ bisacrilamida (29:1). Foram utilizados de 8-10 L do produto de PCR e 2 L de tampão de amostra. Utilizou-se a coloração com nitrato de prata para a identificação das bandas de RAPD. Após a revelação com prata os géis foram fotografados com luz branca.
	As bandas em cada locos foram identificadas, baseando-se na presença ou ausência de bandas de tamanhos moleculares idênticos, foram usados para a construção de uma matriz de similaridade com base no cálculo do coeficiente de similaridade de Jaccard [15]. O tamanho dos fragmentos dos marcadores de RAPD foram obtidos por comparação com o marcador de peso molecular Phi-X174/HaeIII, com 11 bandas variando de 72 a 1353pb. A fim de representar graficamente o padrão de divergência genética, a matriz de similaridade foi submetida a uma análise de agrupamento UPGMA. As análises de divergência genética foram realizadas utilizando o pacote NTSYS 1.5 [14].
	 Para avaliação da diferença nos coeficientes de similaridade genética entre gerações e para a comparação de similaridade entre sexos dentro de gerações e entre gerações foi utilizada a análise de variância (ANOVA). 

Resultados e Discussão

	O DNA se apresentou com bandas integras e sem rastro, indicando que não ocorreu degradação e nem contaminação do DNA com excesso de proteína. Todos os primers examinados produziram diferentes padrões de fragmentos. Foram obtidos com os quatro primers 26 loci, sendo que o primer D03 foi o que apresentou mais loci (11). RAPD é uma técnica de fácil implementação, apresenta bons resultados e produz baixo erro estatístico [10], [13].
	Pôde-se observar que as similaridades entre os indivíduos parentais variaram, desconsiderando as correlações com valores zero, de 0,125 a 0,944, e para a F1 variou de 0,100 a 1,00, com médias de 0,659  0,17 e 0,663  0,19, respectivamente. Isso mostra uma pequena redução da variabilidade dos parentais com relação a F1. A similaridade entre todos indivíduos variou de 0,100 a 1,00 com média de 0,604  0,19.
	Pela análise de agrupamento ocorreu a formação de dois grupos. Dentro do grupo maior observam-se dois subgrupos, um com 80,0% de indivíduos F1 e 20,0% de parentais, em que a distância variou de 0,582 a 1,000. O outro subgrupo encontra-se somente indivíduos parentais, representando 50,0% do total dos parentais, e a similaridade variou de 0,447 a 0,944. O outro grupo é composto por 30,0% dos parentais e 20,0% de F1, e a similaridade variou de 0,638 a 0,885. Isso mostra um agrupamento maior para a F1 em relação aos parentais, indicando que são mais similares que os parentais.
	Tendo sido colocado como causa do aumento da consangüinidade a forma de reposição dos estoques, o sistema de acasalamento, este parece ser o caso nesta situação, onde se utiliza a relação de 1 macho para 3 fêmeas e, portanto a maior contribuição para o tamanho efetivo da população que está sendo renovada é dependente dos machos. Como conseqüência a similaridade tenderia a aumentar devido ao acasalamento de indivíduos aparentados, pois o tamanho efetivo não é de 150 reprodutores por lote, mas sim de 30, o qual é o número aproximado de machos por lote de produção [11]. 
	Apesar da similaridade média ter sido menor na F1, o que poderia caracterizar como maior variabilidade genética, houve um maior agrupamento dentro de machos e fêmeas do que em relação à geração parental. Além disso, valores maiores de similaridade foram obtidos na comparação pareada dentro da progênie. Provavelmente possa ser o resultado do maior grau de parentesco dentro de sexo, e a menor média um resultado do menor parentesco quando comparada entre sexos. 
	Pelo trabalho realizado é possível utilizar o marcador de RAPD para orientar a organização dos lotes, de forma a manter a maior variabilidade genética. É óbvio que toda a variação genética de uma espécie não pode ser conservada. 

Conclusão

Pode-se concluir que o marcador RAPD, como ferramenta para a comparação da variabilidade genética, demonstrou que os indivíduos da progênie, F1, ficaram mais agrupados, mais semelhantes, em relação aos parentais, podendo demonstrar uma redução da variabilidade. Contudo, não é possível dizer se a redução na variabilidade foi resultante do processo de seleção por peso, haja visto que foi realizada a seleção em apenas uma geração.

Referências Bibliográficas

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