Análise do potencial citotóxico e genotóxico da água do arroio São Lourenço, São Lourenço do Sul
Iganci, J. R. V.1, 2*; Heiden, G. 1, 2; Bütow, M. 2; Stein, V. 2, 3; Bobrowski, V. L.4
1:Bolsista PIBIC CNPq, DZG/IB, Universidade Federal de Pelotas (joaoiganci@terra.com.br); 
2:Graduando em Ciências Biológicas, estagiário DZG/IB, Universidade Federal de Pelotas;
3:Bolsista FAPERGS;
4:Professor Adjunto DZG/IB, Universidade Federal de Pelotas (Vera.bobrowski@ufpel.edu.br).

Introdução

O Allium teste desenvolvido por Levan [9], tornou-se uma ferramenta útil para a pesquisa básica do potencial genotóxico e citotóxico de produtos químicos, substâncias complexas como extratos de plantas, dejetos industriais e águas contaminadas.  É um teste sensível, rápido, barato e de fácil execução. 
Através do Allium teste podemos avaliar dois tipos de toxidade: macroscópica, nas raízes dos bulbos de cebola, e microscópica, com redução do índice mitótico e aberrações cromossômicas como: cromossomos em anel, pontes cromossômicas, cromossomos pegajosos, retardos cromossômicos, que ocorrem principalmente nas fases de metáfase e anáfase e formação de micronúcleos observados na interfase. Outra vantagem do Allium teste é não requerer extração ou isolamento de substâncias da amostra e possuir boa correlação com o teste em animais. As plantas eucarióticas têm mecanismos eficazes em metabolizar compostos estranhos a elas (oxidação, hidrólise e redução) e possuem processos de divisão celular e mutações similares aos do homem. 
Em experimentos com quinze produtos químicos onde os resultados foram comparados com resultados do teste de Ames e teste de carcinogênese em roedores, o Allium teste apresentou 82% de sensibilidade. Em caso de estudos de extratos anticâncer é importante que a redução no índice mitótico seja lenta e gradual, para que não ocorram aberrações cromossômicas, e de efeito prolongado permitindo reduzida capacidade de recuperação das células. Estes efeitos podem ser perfeitamente observados através do Allium teste. 
Este teste tem sido validado internacionalmente como bioindicador de amostras ambientais [5]. Portanto, o Allium teste pode ser utilizado como teste preliminar para avaliar potencial genotóxico e citotóxico de substâncias cancerígenas e como bioindicador de contaminação ambiental.
O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico e genótoxico de amostras de água do arroio São Lourenço, na cidade de São Lourenço do Sul, verificando os possíveis efeitos em células meristemáticas radiculares de cebola, através da aplicação do Allium teste como bioindicador.

Materiais e Métodos

1. Locais de coleta de água:

Os pontos de coleta de água foram selecionados com base em critérios ambientais e sanitários. Três áreas de influência foram delimitadas:
(1) Região de coleta de água para abastecimento da população da cidade;
(2) área próxima a esgotamento in natura, onde houve remoção das macrófitas aquáticas;
(3) área próxima a esgotamento in natura, com presença de macrófitas aquáticas.
	A água coletada em vidros pré-esterilizados foi transportada ao Laboratório de Biologia Celular, Departamento de Zoologia e Genética, do Instituto de Biologia, onde foram realizadas as posteriores análises.
 
2. Análise de citoxicidade e genotoxicidade das amostras de água:

Para análise das amostras de água nos diferentes pontos do arroio sobre a divisão celular em células meristemáticas de cebola, utilizou-se 10 bulbos de cebola, para cada ponto de coleta, que tiveram a área radicular imersa nas diferentes amostras de água do arroio e em água destilada como controle negativo.  O material foi mantido na água, acondicionado em tubos de ensaio fixos em estantes, por 72 horas, sendo que a água testada foi trocada a cada 24 horas.  
Para avaliar a genotoxicidade das amostras de água, duas raízes de cada bulbo foram retiradas após 48 h, misturadas aleatoriamente e fixadas em álcool etílico e ácido acético (3:1) por 24 h e depois transferidas para álcool 70% e mantidas na geladeira. 
Para a confecção de lâminas, as raízes foram hidrolisadas em HCL 5N por 15 minutos, coradas com orceína acética 2% e as lâminas foram observadas em microscópio óptico com objetiva de 40X. O método de contagem foi o de varredura, onde foram analisados o índice mitótico, a presença de micronúcleos e alterações metafásicas e anafásicas para detecção de danos ao DNA.
Para análise do índice mitótico e de presença de micronúcleos foram avaliadas 250 células por lâmina e 10 lâminas por amostra, totalizando 2500 células. Para verificar aberrações durante metáfase e anáfase foram contadas 50 células por lâmina e 10 lâminas, num total de 500 células por amostra, segundo metodologia descrita [6]. 
Os resultados foram avaliados através da análise da variância e do teste de Duncan para a comparação de médias.

Resultados e Discussão

A análise do Índice Mitótico das células meristemáticas de cebola não demonstrou uma variação significativa entre os diferentes pontos de coleta de água, esta análise das médias obtidas foi feita pelo teste de Duncan. O mesmo foi observado quanto à presença de Micronúcleos, embora o fato da existência destes em várias análises pode indicar a presença de algum tipo de agente genotóxico indutor da anomalia, pois não podemos simplesmente desconsiderar a presença destas, mesmo não sendo estatisticamente significativa.
Já as análises de aberrações cromossômicas em divisões metafásicas e anafásicas apresentaram grande diferença entre os tratamentos, sendo que o Ponto 3 foi o que apresentou maior variação em relação ao grupo controle, segundo o teste de Duncan. Dentre as anomalias encontradas, verificou-se principalmente quebras no fuso acromático e atrasos cromossômicos. Este ponto expressa o acúmulo de dejetos domésticos que são liberados no arroio durante o seu curso. Quando a carga dos esgotos lançados excede a capacidade de autodepuração do corpo de água, o rio fica sem oxigênio, provocando problemas estéticos, liberação de odor e impedindo a existência de peixes e outros seres aquáticos [3], [4], [1]. Todos os organismos vivos dependem de alguma forma do oxigênio para manter os processos metabólicos de produção de energia e de reprodução [7], [8].
Utilizando metodologia similar à descrita neste trabalho, Büttow et al. [2], observaram ação genotóxica, como cromossomos em anel, atrasos cromossômicos e anáfases desorganizadas, em células de cebola tratadas com água do Arroio Pelotas.

Conclusão

Com base nestes resultados, podemos concluir que o Allium teste é um eficiente bioindicador ambiental. Tendo se mostrado sensível às substâncias presentes na água. A água do Arroio São Lourenço provocou alterações citogenotóxicas nas células meristemáticas radiculares de cebola, que foram observadas através de aberrações cromossômicas durante as divisões metafásicas e anafásicas. Não foi observada uma variação considerável quanto ao efeito citotóxico da água sobre as células, uma vez que o Índice Mitótico não diferiu significativamente entre o grupo controle e os tratamentos analisados. 

Referências Bibliográficas

[1]BRANCO, S. M. Poluição: A morte de nossos rios, 2.ed. São Paulo: Ascetesp. 1983, 166 p.
[2]BUTTOW, Miriam V, CASSANA, F., BOBROWSKI, V. L., ROCHA, B. H. Gomes. Biomonitoramento da água do arroio Pelotas-RS utilizando Allium Test. In: Resumos da I Jornada de Iniciação Científica - Meio Ambiente,m Porto Alegre, RS, 2004.
[3]CETESB, Qualidade das águas no Estado de São Paulo. São Paulo, 1988, (Águas e Energia Elétrica, n.14, p.11-22).
[4]ESTEVES, F.A. Fundamentos de Limnologia. Rio de Janeiro: interciência/Finep, 1988. 575 p.
[5]EVSEEVA, T.I.; GERAS´KIN, S.A.; SHUKTOMOVA, I.I. Genotoxicity and toxicity assay of water sampled from a radium production industry storage cell territory by means of Allium-test, J. Environ. Radioactivity, v.68, 235-248, 2003.
[6]MONARCA, S.; FERETTI, D.; COLLIVIGNARELLI, C.; GUZZELLA, L.; ZERBINI, I.; BERTANZA, G.; PEDRAZZANI, R. The influence of different disinfectants on mutagenicity and toxicity of urban wastewater, Water Res., v. 34, n.17, 4261-4369, 2000. 
[7]PORTO, R. La L. (Org.). Hidrologia ambiental. São Paulo: Edusp, 1991, 411 p. (Coleção ABRH de Recursos Hídricos, v. 3).
[8]RINGUELET, Raul A. Ecología Acuática Continental. Eudeba Editorial, Universidade de Buenos Aires, 1962, p.82
[9] VILCACORA – undeniable evidence in black and white. Dr Mieczysław Kuraś, Professor of botany from the Warsaw University, interviewed by Roman Warszewski. In: http//www_vilcacora_com_pl-archiwum2004-czarno-bialo_eng.htm. 22/08/2004, 13:16h.