Leptospira interrogans: CLONAGEM MOLECULAR E EXPRESSÃO DO GENE lemA EM Escherichia coli
Hartwig, D. D.1*; Cerqueira, G.M.1; McBride, A. J. A.1; Dellagostin, O. A.1
1Laboratório de Biologia Molecular - Centro de Biotecnologia - CENBIOT - UFPEL
Campus Universitário s/n - Caixa Postal 354 - CEP 96010-900  
*dhartwig.ib@ufpel.edu.br

1	INTRODUÇÃO

 A leptospirose é uma zoonose de caráter agudo e endêmico, causada por bactérias do gênero Leptospira spp. É uma doença considerada reemergente que afeta pessoas em todos os continentes, tanto em zonas urbanas como em rurais, de países de clima tropical ou temperado. 
Sua prevenção depende especialmente de controle sanitário, já que a contaminação humana costuma ocorrer por contato direto à urina de animais portadores, ou através de solo ou água contaminados [2], produzindo uma ampla variedade de manifestações clínicas como febre, calafrios, dor de cabeça e mialgias, podendo evoluir para um quadro mais grave com complicações sistêmicas, como falhas renais e hemorragias.
Nos principais centros urbanos de países em desenvolvimento, como o Brasil, o aumento de moradias em áreas impróprias e sem condições sanitárias adequadas acompanha o desenvolvimento das cidades, onde o contato com urina de ratos seria o principal modo de contaminação. Desta maneira a leptospirose costuma ocorrer como epidemia urbana com índices de mortalidade, principalmente durante os períodos de chuva [6]. No estado do Rio Grande do Sul a incidência de leptospirose fica em torno de 10 casos por 100.000 habitantes, sendo superior à média do país que é de 3,5 casos por 100.000 habitantes. Na região sul cerca de 69% dos casos ocorrem na zona rural, principalmente em áreas com atividade agrícola [1]. 
O desenvolvimento de vacinas vem sendo proposto como estratégia na prevenção da leptospirose. Contudo, as vacinas até então desenvolvidas se baseiam em porções da célula ou da membrana de leptospiras patogênicas, que desencadeiam resposta imune contra o LPS [3], embora a proteção nestes casos seja curta, não conferindo imunidade contra outros sorovares.
Leptospira interrogans sorovar Copenhageni é uma espiroqueta altamente patogênica de caráter invasivo, que causa uma série de infecções em maníferos. O estudo molecular das sequências que compõem seu genoma contribui para uma melhor compreensão de sua fisiologia e mecanismos de patogenicidade, o que auxilia na identificação de possíveis candidatos ao desenvolvimento de vacinas [5]. 
No ano de 2003 foi publicado o mapa referente ao seqüenciamento do genoma de Leptospira interrogans, o qual contém uma ampla listagem de genes envolvidos na biologia deste microrganismo e cujo estudo permitirá uma melhor compreensão de sua fisiologia, mais especificamente sua patogenicidade, que apresenta especial importância para nosso grupo de pesquisa, o qual vem pesquisando tais genes com o intuito de encontrar candidatos em potencial para o desenvolvimento de uma vacina mais eficiente na prevenção da leptospirose.
 
2	MATERIAIS E MÉTODOS

O gene lemA foi amplificado através da técnica de PCR, utilizando a enzima Taq DNA Polymerase (Invitrogen) e clonado no plasmídeo pQE 30 que permite a expressão da proteína de interesse fusionada a uma cauda de histidina. 
Os primers foram desenhados a partir da seqüência depositada no GeneBank sob o número de acesso NC005823, derivada do seqüenciamento de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni L1 130 (Fiocruz), com o auxílio do programa VectorNTI 8.0 (Informax inc.). 
Cepas de E. coli TOP10 competentes foram transformadas através de eletroporação [7] e cultivadas em placas contendo ágar Luria-Bertani (LB-Difco) com 100 g/mL de ampicilina. Das colônias que cresceram nas placas foi feita uma triagem rápida com fenol clorofórmio [4], para verificar a presença de clones recombinantes. Dos clones identificados extraíu-se o plasmídeo, o qual foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BglII para comprovar a presença do inserto. Os clones recombinantes foram cultivados até a fase log de crescimento, sendo uma amostra da cultura (cerca de 5 mL) induzida com 1 mM IPTG.
As amostras foram submetidas a um SDS-PAGE, com concentração  de 15%, no qual foi utilizado o marcador de massa molecular SeeBlue® Plus Pre-Stained Standard 1x (Invitrogen), e também a um Western blot utilizando um anticorpo monoclonal anti- histidina (Sigma) para confirmar a expressão da proteína recombinante. 
A proteína recombinante LemA será, posteriormente, purificada através de um sistema de cromatografia de afinidade, em um equipamento automático denominado AKTAPrimer. As amostras da proteína de interesse obtida na purificação serão avaliadas quanto à pureza, através de um SDS-PAGE e concentração, através do método Bradford.

3	RESULTADOS E DISCUSSÃO
 
O gene lemA amplificado, que possui 424 pares de bases (pb) (Figura 1), foi purificado e ligado ao vetor pQE 30. Dos clones recombinantes obtidos extraiu-se o DNA plasmidial, que foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BglII para confirmar a presença do inserto. Dois clones recombinantes foram selecionados e denominados pQE/lemA. O mapa do plasmídio destes clones encontra-se na Figura 2. 

    1          2

 506 pb

Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose 1% do produto de PCR. Coluna 1, marcador de massa molecular 1Kb DNA Ladder; coluna 2, gene lemA amplificado (424 pb). 

pQE30/lemA

3832 bp

6X-His Tag

Ampicillin

lemA

rrnB T1 Transcriptional termination

Lambda To transcriptional termination

Transcription start

ATG

Primer Forward F2

Primer Reverse F2

T5 promoter/Lac operator

RBS

Col E1 origin

Bam

HI (3828)

Eco

RI (3771)

Hin

dIII (409)

Xba

I (1385)

Xho

I (3684)

Figura 2 – Mapa de restrição do plasmídeo pQE/lemA.
Nas amostras de pQE/lemA induzidas com IPTG e submetidas ao SDS-PAGE com concentração de 15%, pode-se observar, com base no marcador de massa molecular, uma banda mais intensa na altura de 15 kDa, que indica a proteína LemA (Figura 3). A proteína LipL32 purificada foi utilizada como controle positivo.

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Figura 3 – SDS-PAGE 15% corado com Comassie Blue. Coluna 1, marcador SeeBlue® Plus Pre-Stained Standard 1x; Coluna 2 e 4, clones recombinantes pQE/lemA induzidos com IPTG; coluna 3 e 5, clones recombinantes pQE/lemA não induzidos; coluna 6, LipL32 purificada (32 kDa);

 98 kDa

 50 kDa

 64 kDa

 36 kDa

    22 kDa

 16 kDa

6 kDa

Para comprovar a presença da proteína LemA os clones foram submetidos a um Western blot, no qual utilizou-se um anticorpo monoclonal anti-histidina (Figura 4). Verificou-se uma banda na altura desejada (15 kDa) para os dois clones de pQE/lemA induzidos, o que indica seu reconhecimento pelo anticorpo anti cauda de histidina. No entanto, em um dos clones não induzidos também foi verificada a presença de uma banda na altura de 15 kDa, resultado este não esperado e que pode ter sido causado pelo vazamento das amostras adjascentes.  A presença de bandas acima da altura de 15 kDa será posteriormente analisada por novo Western blot, utilizando diferentes controles.

Figura 4 – Western blot . Coluna 1, marcador SeeBlue® Plus Pre-Stained Standard 1x; Coluna 2 e 4, clones recombinantes pQE/lemA induzidos com IPTG; coluna 3 e 5, clones recombinantes pQE/lemA não induzidos; coluna 6, LipL32 purificada (32 kDa);

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4	CONCLUSÕES

Foi possível expressar o gene lemA de Leptospira interrogans em Escherichia coli utilizando o sistema de expressão baseado em pQE 30, o qual permite a expressão deste gene fusionado a uma cauda de seis histidinas. Esta proteína será posteriormente purificada por um sistema de cromatografia de afinidade para avaliar  sua imunogenicidade para uso em diagnóstico e produção de vacinas.

5   REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] BARCELLOS, C.; LAMMERHIRT, C. B.; ALMEIDA, M. A. B. de; SANTOS, E. dos. Distribuição espacial da leptospirose no Rio Grande do Sul, Brasil: recuperando a ecologia dos estudos ecológicos. Cad Saúde Pública, 19 (5): 1283-1292, 2003.
[2] BARTHI, A. R.; NALLY, J. E.; RICALDI, J. N.; et al. Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance. Lancet Infect Dis, 3: 757-71, 2003.
[3] FAINE, S.; ADLER, B.; BOLIN, C,; PEROLAT, P. Leptospira and Leptospirosis. Second Edition, MediSci Writing, Armadale Vic, Australia, 1999.
[4] JOUGLARD, S.D.; MEDEIROS, M.A.; VAZ, E.K.; BASTOS, R. G.; DA CUNHA, C.W.; ARMOA, G.R.G.; DELLAGOSTIN, O.A. An Ultra-Rapid and Inexpensive Plasmid Preparation Method for Screening Recombinant Colonies. Abstracts American Society for Microbiology. H-71, p. 234, 2002. 
[5] NASCIMENTO, A. L. T. O; ALMEIDA, S. V.; VAN SLUYS, M. A.; et al. Geanome features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Braz J Med Biol Res, 37: 459-478, 2004.
[6] ROMERO, E. C.; BERNARDO, C. C. M.; YASUDA, P. H. Human leptospirosis: a twenty-nine-yer serological study in São Paulo, Brazil.  Rev Inst Med Trop S Paulo,  45(5): 245-248, 2003.
[7] SAMBROOK, J. & RUSSEL, D.W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 3rd Edition. 2001.