Produção de conjugado para DIAGNÓSTICO De LEPTOSPIROSE POR imunofluorescência direta
Fernandes, C.P.H.1*; Coutinho, M.L.1; Santos, P.C.1 ; Goularte, K.L.1; Vasconcellos, F.A.1; Moreira, Â.N.1; Goularte, F.L.1; Bermudes, V.2, Ludke, C.B.3; Krahl, M.3, Brod, C.S.2; Aleixo, J.A.G.1
1Laboratório de Imunologia Aplicada – Centro de Biotecnologia – CenBiot/UFPEL
2Centro de Controle de Zoonoses – Faculdade de Veterinária/UFPel
3Médico Veterinário
Campus Universitário  – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900  
* clauhart@terra.com.br

1.	INTRODUÇÃO

	A leptospirose é uma zoonose de importância em saúde pública, podendo acometer diversas espécies animais.  A identificação do agente, bactérias do gênero Leptospira, é importante na fase aguda da doença, quando a detecção de anticorpos é pouco sensível, para possibilitar a instituição de tratamento adequado e interrupção da cadeia epidemiológica da doença [4]. Também é destacada a importância da identificação do agente em tecidos biológicos pós-mortem de animais domésticos e silvestres, para detectar a presença do agente etiológico nas populações animais de um ambiente [2].
	Um sorovar patogênico canino, cepa CCZ Tande, isolado no Centro de Controle de Zoonoses da UFPel foi caracterizado por PCR e sequenciamento do gene rDNA 16S, apresentando 100 % de homologia com Leptospira interrogans sorovar canícola. A caracterização desta cepa quanto à reatividade com soros humanos e animais positivos para leptospirose apresentou reação com 100% das amostras humanas testadas e 72% das amostras caninas, não reagindo com amostras de soros negativas e positivas para outras doenças. Além disto, o título de anticorpos das amostras foi maior quando testada com esta cepa comparada com títulos contra uma cepa da mesma espécie genômica, usada na bateria de antígenos para  o teste de soroaglutinação microscópica (MAT) [1]. Estes resultados concordam com a importância do uso de isolados locais para diagnóstico tanto sorológico como de identificação de antígeno, através do uso de anticorpos produzidos contra estes isolados [7].
Este trabalho descreve a produção de um conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) e anticorpo policlonal anti-Leptospira interrogans cepa CCZ Tande para uso na detecção de leptospiras por imunofluorescência direta.

2.	MATERIAL E MÉTODOS

A cepa Leptospira interrogans CCZ Tande foi cultivada conforme protocolo estabelecido [3]. A suspensão de bactérias contendo 108 bactérias /ml foi lavada três vezes em tampão PBS pH 7.4, suspendida em solução salina pH 7.2 e inoculada em coelhos New Zealand com 3 meses de idade. Após intervalo de 14 dias, a mesma dose do inóculo foi administrada em intervalos de 7 dias até o total de  6 inoculações. A avaliação da resposta imune foi realizada através da MAT após a terceira inoculação. Finalizada a imunização, o coelho foi sacrificado para obtenção do soro hiperimune. O soro obtido foi purificado por cromatografia de afinidade em coluna de proteína A Sepharose [5] e a concentração de IgGs foi determinada a 280nm. Para conjugação, 1 ml de PBS pH 7,4 com o anticorpo policlonal purificado (25mg/ml) foi misturado com 200 ul de carbonato bicarbonato 0,5M pH 9,5 e dializado por 16 horas a 40C contra solução de NaCl  0,85% contendo 1,2 ml de FITC (750 g/ml). A preparação foi retirada e dializada contra solução de NaCl 0,85% durante 3 horas e contra tampão PBS pH 7,5 por 16 horas. Após, a solução foi recolhida e acondicionada a - 200C. Lâminas de vidros cobertas com poli-L lisina foram utilizadas para depositar 30ul de cultivos contendo 108/leptospira/ml das cepas CCZ Tande, canícola e sorovar saprófita Patoc patoc 1. Depois de secas a temperatura ambiente por duas horas as lâminas foram fixadas em metanol por 10 min, bloqueadas com SFB 10%, lavadas com PBS pH7,4 e  a cada cepa adicionado 1 ul do conjugado fluorescente, seguido de incubação por 2h a 370C em câmara úmida e escura. Após incubação as lâminas foram lavadas, secas a temperatura ambiente, cobertas com meio de montagem e lamínulas e submetidas à leitura em microscópio de fluorescência com filtro U.V.

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO

O conjugado CCZ Tande-FITC reagiu com as cepas CCZ Tande e canícola e não reagiu com a cepa saprófita Patoc patoc 1, indicando a especificidade do anticorpo pela espécie genômica e sorogrupo de leptospira, concordando com  conjugado anteriormente produzido [6]. A fluorescência emitida foi clara e capaz de definir leptospiras no aumento de 400 x e 1000x , mostrando fluorescência intensa. A diluição 1:30 usada no teste foi capaz de detectar leptospiras fixadas indicando a possibilidade de aumento da diluição testada. Amostras clínicas de sangue e urina contendo leptospiras necessitam de uma concentração de 104 bactérias/ml para que seja visualizada uma leptospira por campo na microscopia em campo escuro. O conjugado produzido foi testado com uma alíquota de 30ul contendo 105 bactérias/lâmina, portanto acima do limite de detecção do teste.  É possível, no entanto, atingir o limite de detecção através da concentração das bactérias da amostra clínica por centrifugação em alta rotação e suspensão em menores volumes. 

4. CONCLUSÕES

O conjugado produzido foi específico para leptospira patogênica, sendo capaz de detectá-las com boa definição, e não reagiu com o sorovar saprófita usado como controle negativo. A próxima etapa do experimento compreenderá a avaliação do conjugado com amostras clínicas artificialmente contaminadas e amostras clínicas com confirmação de leptospirose.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] BROD,C.S., ALEIXO, J.A., JOUGLARD, S.D., FERNANDES, C.P.H., TEIXEIRA, J.L.R., KRAHL, M., DELLAGOSTIN, O.A. The importance of the use of a local isolate on detection of antibody in humam and canine serum samples. International Leptospirosis Society. 3rd Scientific Meeting, Bridgetown, Barbados, 2002.
[2] CORDEIRO, F. Leptospira interrogans in several wildlife species in Southeast Brazil. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.1, n.1, p.19-29, 1981.
[3] FAINE, S. 1982. Guidelines for the Control of Leptospirosis. Geneve, World Healt Organization, ( Who Offset Publication no 67).
[4]	FAINE, S., ADLER, B., BOLIN, C. and PEROLAT, P. Leptospira and leptospirosis. 2 ed. MedSci, Melbourne, Vic.Austrália, 1999. Leptospirosis. 272 p.
[5] HARLOW E., LANE D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 726 p., 1988.
[6] JOUGLARD, S.D., LUDTKE, C.B., COUTINHO, M.L., FERNANDES, C.P.H., KRAHL, M., KO, A., DELLAGOSTIN, O.A. ALEIXO, J.A.G. Leptospirosis diagnosis – Immunofluorescence and blocking ELISA using polyclonal antibodies and monoclonal antibodies against a specific pathogenic Leptospira antigen. International Leptospirosis Society. 3rd Scientific Meeting, Bridgetown, Barbados, 2002.
[7] LEVETT, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews. 14: 296-326, 2001.