COMPARAÇÃO DE TÉCNICAS DE MICRONÚCLEOS PARA AVALIAÇÃO DE GENOTOXICIDADE EM CÉLULAS HUMANAS
Vilanova, L.B.1,4*; Cattelan, L.V.1,4; Lima, M.C.1,4; Gameiro, P.H.1,4;Bobrowski, V.L.2,4; Vianna, R.A.P. 3,4; Rocha, B.H.G.2,4
1Acadêmica do Curso de Ciências Biológicas/UFPel
2Professor Adjunto DZG/IB/UFPel
3Professora substituta DZG/IB/UFPel.
4Laboratório de Genética Humana – DZG – IB/UFPel
Campus Universitário, s/n – CEP 96010-900 – Pelotas/RS
* laura_vilanova@hotmail.com

1. INTRODUÇÃO

Populações de centros industriais são expostas intensivamente a substâncias químicas, que podem causar mutações, câncer e defeitos congênitos [3]. No ambiente de trabalho são encontrados, freqüentemente, agentes químicos, físicos e biológicos capazes de causar problemas aos trabalhadores, induzindo a vários tipos de câncer como os do trato urinário, da pele, da laringe, do pâncreas e leucemias [8].
Uma maneira de estudar os efeitos em uma população exposta é conduzir estudos de monitoramento, utilizando parâmetros biológicos pertinentes com manifestações em curto prazo, tais como ensaios citogenéticos, que podem identificar danos resultantes da exposição. A informação obtida pode ser usada como um aviso precoce do risco potencial do desenvolvimento, em longo prazo, de problemas de saúde [1].
Estudos realizados têm confirmado a hipótese de que as alterações cromossômicas são o evento inicial da carcinogênese [1]. 
O formaldeído (CH2O), comercialmente conhecido por formol, apresenta efeitos tóxicos em pessoas expostas a uma dosagem considerável, que pode ser desde a irritação na pele, nos olhos, nariz e garganta, como provocar dor de cabeça, tontura, náusea, dificuldade de respirar e até estimular o aparecimento de tumores malignos [5]. Suspeitas de que o formaldeído pode ser cancerígeno em humanos, teve evidências na ação em ratos, como mostra o Registry of Toxic Effects of Chemical Substances (RTECS & EPA).
Para avaliar a ocorrência de mutações em uma célula, é preciso utilizar algumas técnicas, como o Teste de Micronúcleos, pois é simples, prático e de baixo custo [6]. O micronúcleo (MN) é um núcleo adicional e separado do núcleo principal de uma célula, formado durante a divisão celular por cromossomos ou fragmentos de cromossomos que se atrasam em relação aos demais. Resulta de alterações estruturais cromossômicas espontâneas ou experimentalmente induzidas, ou ainda, de falhas no fuso celular, sendo portanto, excluído do novo núcleo, formado na telófase [7]. A técnica de micronúcleos consiste na identificação do aumento na freqüência de mutação em células, que são expostas a uma gama variada de agentes genotóxicos [2].
O presente trabalho teve por objetivo, fazer uma comparação entre dois procedimentos utilizados no preparo de lâminas para a avaliação de genotoxicidade em células humanas através da técnica do Teste de micronúcleos.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo preliminar foi realizado no Laboratório de Genética Humana, do Departamento de Zoologia e Genética da Universidade Federal de Pelotas. Foi analisada uma amostra de 20 indivíduos da UFPel, sendo que destes, doze expostos ao formaldeído e oito não expostos, como grupo controle.
O estudo foi realizado em células esfoliadas do tecido epitelial da mucosa oral, obtidas através de raspagem com espátula de madeira. Duas áreas distintas da cavidade oral desses indivíduos foram submetidas à coleta de células para análise de freqüência de micronúcleos: (A) lado direito e (B) lado esquerdo.
Uma das metodologias testadas consiste em colocar o material coletado em tubos cônicos de centrífuga, com cerca de 4mL de soro fisiológico, centrifugado por 10 minutos, a 1000rpm, com posterior retirada do sobrenadante, deixando somente o pellet; a este, adicionou-se 4mL de fixador Carnoy, ressuspendendo o material e centrifugando-o, por 5 minutos, a 1000rpm. Neste mesmo fixador, foi ressuspendido o pellet e centrifugado novamente, por 5 minutos, a 1000rpm, e após, retirado 3,7mL do fixador. Seguido a este processo, ressuspendeu-se o material e pingou-se 3 gotas em cada lâmina previamente limpa, deixando-o secar por completo, por 1 hora, em estufa a 25°C, para posterior hidrólise, coloração de núcleo e citoplasma, respectivamente.
	Na outra metodologia, o material coletado foi estendido diretamente na lâmina previamente limpa, deixando secar à temperatura ambiente por aproximadamente 1 hora, sendo feita a fixação com metanol P.A. por 5 minutos, e posteriormente o processo de hidrólise, coloração de núcleo e citoplasma.
A análise das lâminas foi feita em microscópio óptico comum, binocular, com objetiva de 100X e oculares de 10X. Foram observadas 1000 células por indivíduo e os resultados sendo expressos em números de células micronucleadas em 1000 células, registradas em ficha específica.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

		Na técnica de suspensão celular, foi preciso executar três repetições da mesma para obter o número de células necessárias à contagem (1000 células/indivíduo); contudo, tal técnica proporcionou uma melhor distribuição das células, evitando assim sobreposições, além de deixá-las intactas e com pouca sujeira no material.
	Na técnica de esfregaço (lâmina estendida), foi suficiente executar o procedimento apenas uma vez, devido ao grande número de células obtidas. Porém esta técnica favoreceu a sobreposição de células, o que dificultou a contagem das mesmas, além de rompê-las e dobrá-las, deixando um campo de visualização com bastante sujidade.
	Esta técnica foi utilizada por Santos-Mello (1992) [8] e Vianna (2000) [9] em células esfoliadas de mucosa oral de frentistas de postos de gasolina, bem como por Martino-Roth (1999) [4], em trabalhadores expostos à tinta automotiva.

4. CONCLUSÃO

	A metodologia de suspensão celular apresentou um baixo número de células por lâmina, sendo necessária a repetição do procedimento, além de ser mais trabalhosa, demorada e de maior custo, quando comparada à técnica de esfregaço, onde foi obtido um número de células muito superior ao mínimo necessário para contagem.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] AU, W.W.,WALKER, D.M., WARD, J.B., WHORTON, E., LEGATOR, M.S., SINGH, V. Factors contributing to chromosome damage in lymphocytes of cigarette smokers. Mutation Research, 1991, 260:137-144.
[2] CARVALHO, M.B. De, RAMIREZ, ANDREA, GATTÁS, GILKA JORGE F. et al. Correlação entre a evolução clínica e a freqüência de micronúcleos em células de pacientes portadores de carcinomas orais e da orofaringe. Rev. Assoc. Med. Bras., Dez 2002, vol.48, no.4, p.317-322. ISSN 0104-4230.
[3] HIRVONEN, A. Genetic factors in individual response to environmental exposures. Journal Occupational Environmental Medicine, 1995, 1:37-43.
[4] MARTINO-ROTH, M.G. Avaliação da Genotoxicidade Ocupacional em Trabalhadores da Zona sul do Estado através do teste de micronúcleos e ensaio cometa. Tese de doutorado – Biotecnologia, área de concentração: Médica, UFPel, 1999. 119p.
[5] O ORGANISMO HUMANO. Disponível em: <http://www.taps.org.br/ cancer01.htm> Acesso em 25 maio 2004.
[6] RABELLO-GAY, M.N., RODRIGUES, M.A.R., MONTELEONE-NETO, R. Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese: Métodos e Críticas de Avaliação. Ribeirão Preto/SP: Sociedade Brasileira de Genética, 1991. 246p.
[7] RAMIREZ, A. Análise de Células Metanucleadas de Alcoólicos Portadores de Carcinomas Orais. 2000. 126f. Dissertação (Mestrado em Biociências) – Universidade de São Paulo. 2000.
[8] SANTOS-MELLO, R., CAVALCANTE, B. Cytogenetics studies on gas station attendants. Mutation Research, 1992, 280:285-290.
[9] VIANNA, R.A.P. Avaliação da Genotoxicidade Ocupacional em Frentistas de Postos de gasolina da cidade de Pelotas-RS. Monografia de final de curso – Bacharel em Ciências Biológicas, área de concentração em Meio Ambiente, UFPel, 2000, 68p.