importância do uso de isolaDos LOCAIS de leptospiRas nA dETECÇÃO DE ANTICORPOS EM HUMANOS SUSPEITOS DE leptospirose
Seyffert, N.1*; Bermudez, V.L.1; Recuero, A.; Bourscheidt, D.1; Brod, C. S1.
1Laboratório do Centro de Controle de Zoonoses – CCZ – FV – UFPEL
Campus Universitário s/n – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900  
*nbsey@pop.com.br

1.	INTRODUÇÃO

A leptospirose é uma doença bacteriana que afeta animais e seres humanos. É causada por microorganismos espiroquetídeos do gênero Leptospira que são encontrados em urina, sangue e tecidos do homem e de animais infectados [1] O agente invade o organismo por veiculação líquida através das mucosas e da pele lesada ou íntegra. Os sintomas mais comuns da moléstia nos seres humanos são febre, intensa dor de cabeça, na panturrilha e nas articulações. Recentemente, as epidemias de leptospirose humana tem sido descritas relacionadas a enchentes em grandes centros urbanos decorrentes das estações chuvosas [6], sendo assim é considerada reemergente [10]. Esse dado é evidenciado pelo elevado número de casos no Brasil nos últimos anos; em 2000 o número de casos confirmados de leptospirose humana foi de 4.154 e um ano depois, este número atingiu a faixa dos 9.691 casos [4,5]. O RS apresenta alta incidência de leptospirose, com cerca de 10 casos por 100 mil habitantes. O município de Pelotas possui elevada incidência com 10 a 50 casos por 100 mil habitantes [11]. Ao decorrer dos anos pesquisadores tem se empenhado na elaboração de técnicas de diagnóstico laboratoriais mais eficazes [2]. O teste de Soroaglutinação Microscópica com antígenos vivos (MAT) é a base do diagnóstico sorológico sendo amplamente utilizado em todo o mundo, e considerado pelo Ministério da Saúde como padrão-ouro na detecção de anticorpos leptospirais [10]. A maioria, se não todos os antígenos leptospirais utilizados no diagnóstico de determinados laboratórios, são provenientes de regiões [11] com condições bióticas e abióticas distintas da localidade onde o diagnóstico é realizado. A veracidade deste fato é demonstrada em um estudo realizado em 2001 por Brod, revelando através dos resultados do MAT em 105 soros de caninos, onde 72% das amostras positivas reagiram para um novo isolado leptospiral. Também foi constatado que o novo isolado reagiu com pacientes humanos no MAT na ordem de 10% das amostras positivas.
Desde o ano de 1999, o Centro de Controle de Zoonoses tem investido no isolamento de leptospiras tanto de animais considerados reservatórios como também de outros com reduzida importância epidemiológica.
Assim, o presente estudo tem por objetivo comparar a eficiência das baterias de sorovares leptospirais recomendados pela Organização Mundial da Saúde, pelo Ministério da Saúde e a utilizada pelo Centro de Controle de Zoonoses, observando a que obtém melhor performance no diagnóstico laboratorial da leptospirose humana.

2.	MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizadas 314 amostras de sangue humano enviadas ao CCZ/UFPel durante o ano de 2003, como suspeitas de leptospirose. A coleta de sangue ocorria geralmente, no início dos sinais clínicos da enfermidade. Ao chegarem no laboratório, foram centrifugadas a 3.000 x g durante 5 minutos [9], separando-se o soro que foi armazenado em ependorf, processado e guardado em alíquotas no Banco de soros do CZZ para contraprovas ou posteriores experimentos. 
O MAT foi realizado conforme a descrição de Cole et al [7]. Primeiramente, o diagnóstico foi feito, utilizando-se a bateria de rotina do CCZ que possui 48 antígenos leptospirais e 1 leptonema, dentre os quais estão os 19 recomendados pela a WHO. Os antígenos utilizados tinham uma idade de 7 dias e densidade de 1-2 x 108, aferida em câmara de Petroff Hausser. A diluição do soro foi feita em salina com pH 7.2, com diluição inicial de 1:12.5, sendo misturada com igual volume de antígenos. Após incubação de 30°C por 2-3 h, gotas de 3 L foram distribuídas com micropipeta multicanal em lâmina de vidro, para observação em microscopia de campo escuro com um aumento de 150 vezes. A titulação foi realizada naquelas amostras onde ocorreu aglutinação igual ou maior que 50%. Após, o MAT foi realizado da mesma forma, substituindo os 49 sorovares por 7 isolados locais de Leptospira do homem e de diferentes reservatórios animais.
As freqüências, comparações de proporções foram calculadas com Epi Info software versão 6.04 [8].

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

A bateria de sorovares recomendados pela Organização Mundial da Saúde para a realização do MAT inclui 18 sorovares patogênicos e um saprófita, sendo respectivamente, australis, autumnalis, castellonis, bataviae, canicola, cynopteri, grippotyphosa, hebdomadis, icterohaemorrhagiae, copenhageni, javanica, panama, pomona, pyrogenes, hardjo, sejroe, wolffi, tarassovi e patoc [14].
O Centro de Controle de Zoonoses é o único laboratório do país que utiliza na rotina, 44 sorovares leptospirais patogênicos, 3 saprófitas, 1 leptonema e 10 isolados locais no diagnóstico, totalizando uma bateria de 58 antígenos. Após a inclusão destas 10 cepas de leptospiras isoladas de humanos e de diversas espécies de animais da região que abrange o Centro de Controle de Zoonoses, observou-se um aumento da soropositividade.
Das 314 amostras de soro humano, somente 47 (14,97%) foram positivas para a bateria recomendada pela OMS, sendo que apenas 2 (0,63%) das amostras alcançaram título de anticorpos maior que 100. Quando a análise foi realizada com a bateria do CCZ utilizando os critérios de confirmação de casos do Ministério da Saúde (MS), a positividade aumentou para 161 (51,28%) com 12 (3,82%) reações com título  100.
A mesma amostragem foi novamente testada apenas com sete isolados locais, sendo assim, o número de reações aumentou para 181 (57,64%) e as amostras com títulos maiores que 100 para 32 (10,19%).
 Levando em consideração as recomendações do Ministério da Saúde, com a inclusão dos isolados locais a reação antígeno-anticorpo, aumentou para 251 (79,93%) e as amostras com títulos maiores que 100 para 37 (11,79%).
A Tabela 1 apresenta as amostras que reagiram frente a quatro baterias com sorovares leptospirais diferentes.

Tabela 1- Positividade em 314 amostras sorológicas de pacientes humanos, frente a quatro baterias de sorovares leptospirais diferentes, na área de influência do CCZ/UFPel, no ano de 2003.

Tipo Bateria	Título de AC<100	Título de AC>100	Total de Reagentes	
Bateria OMS	45	2	47	
Bateria CCZ Crit. MS	149	12	161	
Isolados Locais	156	32	188	
CCZ+ isolados locais	214	37	251	

O MAT realizado tanto em humanos como em animais, pode revelar resultados falso-negativos. Isso pode ser provocado pela ausência do sorovar causador da enfermidade na bateria de diagnóstico, refletindo diretamente na acurácia do teste. Assim, a recomendação é de que sejam utilizadas cepas de isolados locais no diagnóstico da leptospirose [12,13].
Os sorovares que mais reagiram no ano de 2003 foram: mini, illini, andamana bovedo, patoc, sejroe, rufino; sendo 3 saprófitas, 1 leptonema e 1 patogênico. As reações citadas revelam reação cruzada, uma vez que sorovares saprófitas e leptonema não causam doença no homem. O que se conclui é que os pacientes poderiam estar infectados por sorovares patogênicos ainda não presentes na bateria de diagnóstico.
 Estudos realizados por Brod, 2002 demonstraram que 100% das amostras de soro humano de 12 pacientes do banco de soro de 2001 do CCZ, que haviam reagido com títulos que variaram de 25 a 3200 para o sorovar canicola, e 72% das amostras de 105 soros caninos do mesmo banco de soro, também reagiram contra o isolado local de canino Tande [3]. Assim, pode-se observar, alta porcentagem de reações de antígenos isolados locais de determinadas espécies com soros de espécies diferentes. Em 2004, Silva testou 60 amostras de soros bovinos, com o isolado local de humano Cascata. Do total, ocorreu reação em 26,7% das amostras e os títulos variaram de 10 a 1280 [12].
 No presente experimento, a positividade elevada na segunda MAT com isolados locais, evidencia o valor destes antígenos leptospirais no diagnóstico do CCZ, sendo essencial o investimento no isolamento de novas cepas.

4. CONCLUSÃO

Os isolados locais aumentaram a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico laboratorial da leptospirose humana no Centro de Controle de Zoonoses.

5.	REFERÊNCIAS

[1] ACHA, P.N., SZYFRES, B. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales, 2º ed. Washington: Organizacion Panamericana de la Salud, 1986. p. 112-120.
[2] BAJANI M.D.; ASHFORD D.A.; BRAGG S.L.; WOODS C.W.; AYE T.; SPIEGEL R.A.; PLIKAYTIS B.D.; PERKINS B.A.; PHELAN M.; LEVETT P.N.; WEYANT R.S. Evaluation of four commercially available rapid serologic tests for diagnosis of leptospirosis. Journal Clinical of Microbiology, v.2, p.803-9, 2003.	
[3] BROD, C.S.; ALEIXO, J.A.G.; JOUGLARD, S.D.D.; FERNANDES, C.P.H.; TEIXEIRA, J.L.R.; KRAHL, M.; DELLAGOSTIN, O.A. The importance of the use of a local isolate of leptospira on detection of antibody in human and canine serum samples. 3rd meeting internacional of leptospirosis. Internacional Leptospirosis Society. Barbados. 2002. p.99. 2002. 
[4] BRASIL. Fundação Nacional de Saúde. Boletim eletrônico epidemiológico. Ano 1, nº02, 10/11/2001. Brasília. 11p, 2001.
[5] BRASIL. Fundação Nacional de Saúde. Boletim eletrônico epidemiológico. Ano 1, nº03, 03/08/2002. Brasília. 11p, 2002.
[6] CDC. Outbreak of acute febrile illness and pulmonary hemorrhage - Nicarágua, 1995. Morbidity and Mortality Weekly Report, v.44, p.841-843, 1995.
[7] COLE, J.R.; SULZER C. R.; PURSELL, A.R. Improved micro technique for the leptospiral agglutination test. Applied Microbiol.  v.25(6),p 976-980. 1973.
[8] DEAM, A.G.; DEAM, J.A.; COULMOBIER, D.; BRENDEL K.A.; SMITH, D.C.; BURTON A.H.; DICKER, R.C.; SULLIVAN, K.; FAGAN, R.F.; ARNER, T.J. Epi Info 6 Version 6.04. A word processing, database and statistics program for epidemiology on microcomputers. Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA. 1994.
[9] FAINE, S. Guidelines for the Control of leptospirosis. Geneva. World Health Organization. 1982. 171p. (Who offset publications, 67).
[10] LEVETT, P.N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Review. 2001.14:296-326.
[11] MINISTÉRIO DA SAÚDE. Fundação Nacional de Saúde. Manual de Leptospirose 2o ed. ver. Brasília: FNS, p.98, 1995.
[12] SILVA, E. F. Cultivo e isolamento de Leptospiras do homem, de animais silvestres e domésticos. Pelotas, Estado do Rio Grande do Sul. Pelotas, 2004, 39f. (Tese de mestrado, Medicina Veterinária, UFPel). 2004.
[13] TERPSTRA, et al. Human leptospirosis: Guidance for Diagnosis, Surveillance and Control. World Health Organization, International Leptospirosis Society, p.210, 2003.
[14] WHO. Human Leptospirosis: Guidance for diagnosis, surveillance and control. World Health Organization, 2003, 109 p., 2003.