DETECÇÃO DE Salmonella Typhimurium USANDO SEPARAÇÃO IMUNOMAGNÉTICA ASSOCIADA A ELISA
Moreira, Â.N. 1, 2; Conceição, R.C.S. 1, 2; Ramos, R.J. 1, 2*; Goularte, F.L. 1, 2; Conceição, F.R.3; Fernandes, C.P.H. 1; Coutinho, M.L. 1; Santos, P.C. 1; Goularte, K.L. 1; Carvalhal, J. B. 2; Aleixo, J.A.G. 1, 2
1Laboratório de Imunologia Aplicada - Centro de Biotecnologia/UFPel
2Laboratório de Análises de Alimentos -  Faculdade de Nutrição/UFPel
3Laboratório de Biologia Molecular - Centro de Biotecnologia/UFPel
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1.	INTRODUÇÃO

	O método convencional para detecção e isolamento de salmonelas em alimentos, que compreende pré-enriquecimento em meio não seletivo, enriquecimento e plaqueamento seletivos e testes bioquímicos e sorológicos confirmatórios, é laborioso e geralmente requer 5 a 7 dias para obtenção de resultados [7]. Por isso, vários métodos rápidos têm sido desenvolvidos. Entretanto, muitos métodos rápidos disponíveis para a detecção de patógenos em alimentos são freqüentemente pouco sensíveis, dispendiosos ou requerem um alto nível de habilidade técnica para serem executados [2]. A separação imunomagnética (IMS) é uma técnica de separação e concentração de microrganismos simples, sensível e acessível que tem sido aplicada para reduzir o tempo de isolamento e detecção. 
A IMS usa partículas de látex magnetizadas, cobertas com anticorpos poli ou monoclonais, para remoção dos microrganismos de culturas líquidas através de um magneto [9]. No caso das salmonelas, a técnica tem sido usada para separá-las de outras enterobactérias antes de fazer o plaqueamento em ágar seletivo, para substituir o passo de enriquecimento seletivo [6], associada a ELISA [5] ou PCR [4]. A substituição do passo de enriquecimento seletivo pela IMS é vantajosa pois a concentração de agentes seletivos no caldo de enriquecimento pode ser tóxica para células de salmonelas. Além disso, foi demonstrado que são necessárias 102 a 105 células/ mL no meio de pré-enriquecimento para isolamento de salmonelas usando caldo Rappaport-Vassiliadis [5]. Outra vantagem da IMS é que esta pode recuperar células subletalmente injuriadas mais eficientemente, reduzindo assim o número de resultados falso-negativos [6]. A ocorrência de resultados falso-negativos também é reduzida quando a IMS é associada a PCR, pois esta captura as células alvo e as separa do ambiente contendo inibidores intra ou extracelulares e microflora competitiva [10]. Como em um estudo foi observada a ocorrência de crescimento de organismos não alvos quando a IMS foi associada com métodos de cultivo [2] e devido à sensibilidade, especificidade, rapidez e simplicidade do método ELISA, a IMS também tem sido usada em conjunto com este. O objetivo desse trabalho foi utilizar microesferas magnetizadas cobertas com um  anticorpo monoclonal (MAb) anti-Salmonella Typhimurium para desenvolver um método de IMS associada a ELISA indireto para detecção desta bactéria.

2.	MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Cepas bacterianas e condições de cultivo 

	Foram utilizadas bactérias da coleção de culturas da FIOCRUZ-RJ. S. Typhimurium e E. coli foram mantidas liofilizadas e cultivadas em caldo infusão de cérebro e coração (BHI) por 24 h a 37o C. Contagens foram feitas em placas com agar padrão de contagem em placas (PCA).

2.2 Sensibilização das microesferas com o MAb anti-Salmonella Typhimurium

O MAb utilizado neste trabalho foi produzido em nosso laboratório de acordo com as recomendações de Harlow & Lane [3], é do isotipo IgG2b e específico para uma OMP de S. Typhimurium. As microesferas magnéticas utilizadas são de poliestireno, cobertas com proteína A, com 0,86 m de diâmetro e  suspensas a 1% de sólidos (Bangs Laboratories, Fishers, IN, USA). 
As microesferas foram sensibilizadas de acordo com recomendações de Conceição [1]. Primeiramente foram ressuspendidas em uma concentração de 0,5 mg/mL e lavadas 2 vezes com tampão borato de sódio (pH 8,2, 50 mM). As microesferas foram separadas com imunoseparador magnético (MPC-S, Dynal) e ressuspendidas em 1 mL de tampão borato contendo 0,6 mg do MAb. Após incubação a 4o C por 16 a 18 h, as microesferas sensibilizadas com o MAb foram separadas com o imunoseparador, lavadas novamente e ressuspendidas a 1% de sólidos em tampão de estoque (tampão borato de sódio 10 mM, ph 8,5 + 0,01 BSA + 0,05% Tween 20 + 10 mM EDTA + 0,1% NaN3). Para determinação indireta da quantidade de MAb adsorvido às microesferas, a absorbância do sobrenadante obtido após a sensibilização foi lida em espectrofotômetro a 280 nm. Além disso, as microesferas sensibilizadas foram avaliadas microscopicamente para verificação de ocorrência de auto-agregação e de aglutinação com células de S. Typhimurium e E. coli. 

2.3 Recuperação de salmonelas a partir de cultivos puros por IMS e detecção por ELISA indireto 

Foi investigado o número de células (limite de detecção) de salmonelas necessário para se ter uma reação positiva utilizando a IMS associada à ELISA. S. Typhimurium foi cultivada em BHI a 37o C por 24 h. Este cultivo foi diluído em série decimal com água peptonada a 0,1%. Vinte microlitros das microesferas sensibilizadas foram adicionadas a três alíquotas de 1 mL das diluições e incubadas à temperatura ambiente por 15 min sob agitação constante. As microesferas foram separadas da fase líquida usando o imunoseparador durante 3 min. O sobrenadante foi cuidadosamente aspirado, as microesferas lavadas 3 vezes com PBS e ressuspendidas em 50 L de PBS. Uma alíquota das salmonelas ligadas às partículas foi testada no ELISA diretamente e outra foi adicionada a BHI para um passo adicional de pós-enriquecimento antes do ELISA. As salmonelas destas duas alíquotas foram fervidas a 100o C por 10 min para obtenção de antígenos termoextraídos para utilização no ELISA. Para controle da IMS as salmonelas ligadas às microesferas da terceira alíquota foram semeadas em agar xilose lisina desoxicolato (XLD) para observação de colônias típicas após incubação a 37o C por 24 hs. Foram realizadas 3 repetições deste experimento. 
3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

A sensibilização das microesferas com o MAb foi eficiente, visto que a quantidade de IgG retida nas 0,5 mg de microesferas foi de aproximadamente 0,35 mg. Além disso, ocorreu somente pequena auto-agregação das microesferas sensibilizadas com o MAb, verificada pela avaliação microscópica, e aglutinação apenas das salmonelas, verificada nos testes de aglutinação com cultivos puros de S. Typhimurium e E. coli. 
No experimento de recuperação de S. Typhimurium a partir de cultivos puros, o limite de detecção da IMS associada a ELISA indireto, com e sem pós-enriquecimento em BHI, foi de 10 a 100 e 104 UFC/mL, respectivamente. Em outro estudo, salmonelas foram recuperadas a partir de rações inoculadas com 103 células por 250 mL, utilizando o método IMS associado a ELISA. O tempo total de detecção foi de aproximadamente 21 hs. Após, o método IMS-ELISA foi modificado através da inclusão de um período de incubação de 6 h em caldo GN antes do ELISA e conseguiu-se recuperar 2x102 UFC/250 mL de S. Enteritidis, em cultivo puro [5]. Quando a IMS foi associada à metodologia convencional, o limite de detecção foi de cerca de 10 UFC/mL. Este limite de detecção foi semelhante ao encontrado por MANSFIELD & FORSYTHE [5], que detectaram salmonela em um cultivo contendo 1 a 10 UFC/mL após IMS e plaqueamento em XLD. 
A utilização de MAbs específicos para salmonelas aumenta a especificidade do método IMS, pois soros policlonais anti-salmonelas, que também podem ser usados, freqüentemente apresentam reações cruzadas com outras enterobactérias [8]. 

4.	CONCLUSÕES

	A IMS, utilizando microesferas magnéticas de poliestireno cobertas com MAb anti-S. Typhimurium, é uma técnica eficiente para concentração e separação de salmonelas de culturas líquidas que pode ser usada com sucesso associada a métodos rápidos de detecção como o ELISA indireto, melhorando assim seu desempenho. Um passo adicional de pós-enriquecimento em BHI após a IMS melhora o limite de detecção do ELISA.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1]	CONCEIÇÃO, R.C.S. Detecção de Salmonella em produtos de frango usando a separação imunomagnética. Dissertação de mestrado, DCTA-UFPel, 2004.
[2]	FAVRIN, S.J.; JASSIM, S.A.; GRIFFITHS, M.W. Application of a novel immunomagnetic separation-bacteriophage assay for the detection of Salmonella enteritidis and Escherichia coli O157:H7 in food. International Journal of Food Microbiology, 2003, v. 85, p. 63-71.
[3]	HARLOW, E.; LANE, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1988, p. 726.
[4]	HSIH, H.Y.; TSEN, H.Y. Combination of immunomagnetic separation and polymerase chain reaction for the simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella spp. in food samples.  Journal of Food Protection, 2001, v. 64, n.11, p. 1744-1750.
[5]	MANSFIELD L.P., FORSYTHE S.J. The detection of Salmonella serovars from animal feed and raw chicken using a combined immunomagnetic separation and ELISA method. Food Microbiology, 2001, v.18, p. 361-366.
[6]	MANSFIELD, L.; FORSYTHE, S. Collaborative ring-trial of Dynabeads anti-Salmonella for immunomagnetic separation of stressed Salmonella cells from herbs and spices. International Journal of Food Microbiology, 1996, v. 29, n.1, p. 41-47.
[7]	MOLLA, B.; KLEER, J.; SINELL, H.J. Detection of Salmonella in foods by immunomagnetic separation. Archiv für Lebensmittelhygiene, 1994, v. 45, p. 97-120. 
[8]	OLIVEIRA K.M.P., NAKANOO M.H., HERRERO H., HIDROOKA E.Y., OLIVEIRA T.C.R.M. Produção de anticorpos policlonais para Salmonella Enteritidis. XIX Congresso Brasileiro de Microbiologia, Rio de Janeiro-RJ, 11-15 nov., 1997.
[9]	OLSVIK, O.; POPOVIC, T.; SKJERVE, E.; CUDJOE, K.S.; HOMES, E.; UGELSTAD, J.; UHLEN, M. Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology. Clinical Microbiology Review, 1994, v. 7, p. 43-54.
[10]	SPANOVÁ, A; RITTICH, B.; HORÁK, D.; LENFELD, J., PRODELALOVÁ, J.; SUCIKOVÁ, J.; STRUMCOVÁ, S. Immunomagnetic separation and detection of Salmonella cells using newly designed carriers. Journal of Chromatography A, 2003, v.1009, p. 215-221.