MALASSEZIA PACHYDERMATIS COM CARACTERÍSTICAS LIPO-DEPENDENTES
Rosa, C.S.1 *; Nascente P.S.2; Meinerz, A.R. 2; Souza, L.L. 3; Madrid, I.M. 4; Mello, J.R.B.5; Meireles M.C.A.6.
* Setor de Micologia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, Pelotas, RS, Brasil, Campus Universitário, Cep 96.010.900. Telefone: 2757496 / 91350533. E-mail: csr@ufpel.tche.br
 Médico Veterinário, Mestrando – Programa de Pós Graduação – Faculdade de Veterinária – Universidade Federal de Pelotas (UFPel);
2 Médica Veterinária, Doutoranda – Programa de Pós-graduação em Ciência Veterinária , FAVET, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS);
3 Médica Veterinária – Setor de Micologia/Laboratório de Doenças Infecciosas – Faculdade de Veterinária – UFPel;
4 Estagiária, aluna da Graduação – Faculdade de Veterinária – UFPel;
5 Prof. Dr., Médico Veterinário – Farmacologia - Faculdade de Veterinária, UFRGS;
6 Prof. Dr., Médico Veterinário – Departamento de Veterinária Preventiva – Faculdade de Veterinária – UFPel.

1.	INTRODUÇÃO
A malasseziose é uma enfermidade comum na clínica médica de pequenos animais, sendo até o presente momento, a espécie Malassezia pachydermatis o agente mais estudado nas dermatites e otites causadas por este gênero de leveduras lipofílicas, entretanto, outras seis espécies fazem parte do gênero. 
M. furfur, M. globosa, M. sloofiae, M. restricta, M. sympodialis e M. obtusa são consideradas espécies lipídeo-dependente, pela necessidade de adição de ácidos graxos ao meio de cultura para seu isolamento, porém, M. pachydermatis que também já foi determinada como parte da microbiota de animais hígidos não necessita de adição de lipídeos ao meio de cultura para seu isolamento [10]. Recentemente, as outras espécies de Malassezia vêm sendo descritas como causadoras de otites e dermatites em cães e gatos, o que preconiza uma identificação do agente causador.
As leveduras deste gênero pertencem à família Cryptococcaceae, ordem Cryptococcales, classe Blastomycetes e divisão Deuteromycotina, composto por leveduras com parede celular espessa, com múltiplas camadas, reprodução assexuada com produção de blastoconídeos por um processo monopolar repetitivo ou brotamento, formando uma célula globosa, ovóide ou cilíndrica, quando esta se desliga da célula-mãe [6,7].
Um método para identificação e diferenciação das sete espécies de Malassezia, além do isolamento com e sem suplementação lipídica ao meio de cultivo, é o teste de assimilação dos Tweens 20, 40, 60 e 80, proposto por Guillot et al. [9]. Nos últimos anos, técnicas moleculares de cariotipagem e PCR têm se mostrado confiáveis na diferenciação entre as espécies de Malassezia [8;11] e recentemente alguns autores também realizam a investigação molecular dos isolados de M. pachydermatis obtidos de otite externa e dermatite, como também de isolados de animais hígidos, para um estudo epidemiológico da espécie, demonstrando diferenças moleculares entre essa espécie em quatro subtipos, pelo método Randon Amplified Polimorphic DNA (RAPD) e Chitin Sintetase 2 (CHS2) para análise de freqüência gênica [1].
O presente trabalho tem como objetivo, a pesquisa de leveduras do gênero Malassezia lipo-dependentes ou não em meato acústico de cães sem sintomatologia de otite externa.

2.	MATERIAL E MÉTODOS
Foi pesquisada a presença de leveduras do gênero Malassezia em meato acústico externo de cães sem sintomatologia de otite externa através da colheita de amostras provenientes do meato acústico (direito e esquerdo) de 30 animais (totalizando 60 amostras), utilizando zaragatoas estéreis umedecidas em solução salina. 
Previamente ao cultivo, foi realizado exame direto em todas amostras através de rolamento da zaragatoa utilizada para colheita do material, em lâmina de vidro, para sua fixação e coloração com gram, para visualização em microscopia de imersão (100x).
O material foi então semeado em meio de cultivo ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol e cicloheximida com acréscimo de ácidos graxos. As amostras foram incubadas a 32ºC por até sete dias para posterior identificação. Nas amostras em que houve crescimento da levedura foi realizado repique para meio de cultivo ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol e cicloheximida sem acréscimo de ácidos graxos, para confirmação ou não de lipo-dependencia.
As características bioquímicas foram avaliadas através de testes como produção de uréase e catalase. A reação de catalase foi estudada a partir da integração do esfregaço da levedura, obtida por repique de 24-48hs, com uma gota de peróxido de hidrogênio a 3% em uma lâmina de microscopia que neste contato produzem liberação de O2, no caso das amostras positivas. A hidrólise da uréia foi testada ao semear, com a alça de platina, o inóculo da levedura em meio sólido de uréia. Este material foi incubado a 37ºC por até uma semana para observação da troca de cor do meio, devido à hidrólise da uréia.
O teste de assimilação dos Tweens consiste em adicionar 2ml de uma suspensão da amostra isolada à 16ml de ágar Sabouraud dextrose estéril (contendo 0,05% de cloranfenicol e 0,05% de cicloheximide) para homegeinização em tubo. Essa suspensão da levedura é obtida através da mistura de uma alçada de levedura de colônia em crescimento, com 5ml de água destilada. A mistura deve ser colocada em placa de Petri e logo após a solidificação do meio, quatro poços são feitos adicionando-se 5l de Tween 20, 40, 60 e 80, respectivamente. Incubam-se as placas por uma semana a 32°C, ainda que a capacidade de utilização dos Tweens já apareça em dois a três dias.

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO
Houve isolamento de leveduras em ágar Sabouraud dextrose com suplementação lipídica, em 30 (50%) amostras provenientes de meato acústico externo de cães hígidos. As colônias foram caracterizadas macro e microscopicamente, onde se observaram colônias opacas de coloração amarelo creme, passando a marrom alaranjada conforme envelhecimento, superfície arredondada ou em forma de cúpula, com a medida transversal de 1-3mm e textura seca, friável, granulosa e algumas vezes gordurosa. Na microscopia podem-se observar células redondas ou ovaladas, confirmando as características do gênero Malassezia. Todas amostras em que houve isolamento de levedura, pode-se observar a presença de até cinco células/campo microscópico ao exame direto. 
A reação de catalase foi positiva em 100% (30) das amostras testadas. De acordo com trabalhos prévios para classificação das espécies do gênero Malassezia, somente a M. restricta, espécie lipo-dependente, é catalase negativa [7], descartando dessa forma o isolamento da espécie M. restricta entre as 30 amostras estudadas.
Na seqüência, 14 amostras repicadas em ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol e cicloheximida sem suplementação lipídica apresentaram evidente crescimento com colônias de mesma característica da colônia original, tendo aspecto cremoso de coloração creme, as quais foram classificadas como M. pachydermatis. 
As 16 amostras restantes demonstraram pobre crescimento no novo meio decultivo, apresentando colônias de menor diâmetro que as demais amostras. Relatos anteriores já identificaram amostras de M. pachydermatis com características de lipo-dependência, demonstrando pobre crescimento em ágar Sabouraud dextrose sem suplementação de ácidos graxos, tornando confusa sua classificação e diferenciação de M. furfur, que pode apresentar características semelhantes [2]. 
M. pachydermatis cresce facilmente em meio Sabouraud dextrose não suplementado, mas pode requerer ácidos graxos para um melhor desenvolvimento, como já citado em estudo com M. furfur, que é dependente de suplementação lipídica, porém é considerado que alguns isolados podem crescer pobremente em meio sem suplementação formando colônias muito pequenas [2]. 
É importante ter esta diferenciação de espécies bem definida, uma vez que há pouco tempo foi relatado o isolamento de M. furfur em felinos (assim como a M. sympodialis), duas espécies lipídeo-dependentes. Contrariando o que se imaginava anteriormente ao relatar-se apenas a presença de M. pachydermatis em pequenos animais [3,4].
Após novos repiques, pode-se observar melhor o crescimento das 16 amostras que foram classificadas como M. pachydermatis, ainda que as amostras tenham diferenças das demais encontradas, o que sugere que a heterogeneidade molecular entre a mesma espécie, M. pachydermatis, observada por Aizawa [1] também possa existir no grau de lipo-dependencia.
O teste de assimilação dos Tweens 20, 40, 60 e 80 proporcionou resultados diferentes aos encontrados na literatura [7]. Outros autores também descreveram dificuldade em caracterizar outras espécies por este teste [5].

Figura 1 – Diferença macromorfológica de duas amostras caracterizadas como Malassezia pachydermatis

4.	CONCLUSÃO

O resultado nos mostra que alguns isolados de M. pachydermatis podem apresentar discreto crescimento em meio de cultivo convencional, firmando a importância da suplementação do meio para o diagnóstico de malasseziose rotineiramente, já que esse se torna útil tanto para o isolamento de espécies lipo-dependentes, como também garante o isolamento de M. pachydermatis.
Como importância de estudo epidemiológico, a classificação das espécies através da utilização do teste de assimilação dos Tweens, bem como o uso de novas técnicas como o RAPD-PCR, favorecerá o estudo populacional desta levedura bem como sua relação com as características clínicas.

5.	AGRADECIMENTOS

CNPq, FAPERGS, CAPES

6.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] AIZAWA, T.; KANO, R.; NAKAMURA, Y.; WATANABE,S.; HASEGAWA, A. Molecular heterogenity in clinical isolates of Malassezia pachydermatis from dogs. Vet. Microbiol., v.70, p. 67-75, 1999. 
[2] BOND, R.; ANTHONY R.M.  Characterization of markedly lipid-dependent Malassezia pachydermatis isolates from healthy dog. Journal Applied Bacteriology.  v.78, p.537-542, 1995.
[3] CRESPO, M.J.; ABARCA, M.L.; CABAÑES, F.J.  Isolation of Malassezia furfur from a cat.  Journal of Clinical Microbiology.  Vol. 37, no.5: p.1573-1574, 1999.
[4] CRESPO, M.J.; ABARCA, M.L.; CABAÑES, F.J.  Otitis Externa Associated with Malassezia sympodialis in two Cats.  Journal of Clinical Microbiology.  Vol.38, no.3: p.1263-1266, 2000.
[5] CRESPO, M.J.; ABARCA, M.L.; CABAÑES, F.J.  Atypical Lipid-Dependent Species Isolated from Dogs with Otitis Externa.  Journal of Clinical Microbiology.  Vol.38, no.6: p.2383-2385, 2000
[6] GUÉHO, E.; MIDGLEY, G.; GUILLOT, J.  The genus Malassezia with description of four new species.  Antonie van Leeuwenhoek  v.69, p.337-355, 1996.
[7] GUILLOT, J.; GUÉHO, E.; LESOURD, M.; MIDGLEY, G.; CHÉVRIER, G.; DUPONT, B.  Identification of Malassezia species.  A practical approach.  J. Mycol. Méd.  6: 103-110, 1996.
[8] GUPTA, A.K.; KOHLI, Y.; FAERGEMANN, J.; SUMMERBELL, R.C. In vitro susceptibility of seven Malassezia species to ketoconazole, voriconazole, itraconazole and terbinafine. Br. J. Dermatol., v.142, n.4, p.758-765, 2000.
[9] KEDDIE, F.M. Electron microscopy of Malassezia furfur in tinea versicolor. Sabouraudia, v.5, n.134-137, 1966.
[10] NOBRE, M.O.;  MEIRELES, M.C.A.; GASPAR, L.F.; PEREIRA, D.;SCHRAMM, R. SCHUCH, L.F.; SOUZA, L.; SOUZA, L.  Malassezia pachydermatis e outros agentes infecciosos nas otites externas e dermatites em cães. Ciência Rural, v.28, n.3,  p.447-452, 1998.
[11] SENCZEK, D.; SIESENOP, U.; BÖHM, K. Characterization of Malassezia spécies by means of phenotypic characteristics and detection of eletrophoretic karyotypes by pulsed-field gel eletrophoresis (PFGE) Mycoses, v.42. p.409414, 1999.