DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS EM CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE PEIXES PARA GERAÇÃO DE BANCO DE GERMOPLASMA TRASNGÊNICO

Cavalcanti, P.V. *1,4; Menin, A1,4 ; Barbieri, M. 1,4; Campos, V.F. 1,4; Borges, C.S. 1,4; 
Collares, T. 1,4; Macedo Jr. M.3,4; Deschamps, J.C.3,4; Moreira, H.L.M.1,4

1Laboratório de Engenharia Genética Animal - LEGA
2 Embrapa Clima Temperado – Laboratório de Microscopia Eletrônica 
3 Laboratório de Reprodução Animal  
4 Centro de Biotecnologia – Universidade Federal de Pelotas
CenBiot - Campus Universitário s/n – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900 / RS  
E-mail: pcavalcanti_fv@ufpel.edu.br
Web: www.ufpel.edu.br/lega

1.	INTRODUÇÃO

A otimização da eficiência do processo de produção animal depende do aprimoramento e sucesso de biotécnicas reprodutivas avançadas [2]. A indústria da Aqüicultura vem crescendo e sendo aprimorada nos últimos anos. Estando focada na busca de maior produtividade em um curto período para atender as exigências de mercado, tornando-se necessária a criação e aplicação de novas tecnologias que potencializem essa produção.
Um programa de criação seletiva comercial avançada que objetiva a produção de um fenótipo específico (isto é, peixe de crescimento rápido, com alta conversão alimentar, resistência a doenças, etc.) baseia-se na avaliação das progênies para a seleção dos progenitores, necessitando de várias gerações para obter uma acurácia de seleção, que reflete em grande gasto de tempo.
 Neste sentido, a transferência gênica mediada por células espermáticas e a garantia do armazenamento em banco de germoplasma de espermatozóides geneticamente modificados, diminuiriam significativamente o tempo do refinamento genético dos planteis [9]. 
Para auxiliar o desenvolvimento desta biotécnica faz-se necessário à criação de um banco de germoplasma, para a conservação de células espermáticas transfectadas, as quais poderão ser utilizadas em futuras fertilizações dando origem aos animais geneticamente modificados para genes de interesse, resultando em fenótipos superiores dos planeis classicamente melhorados.
 Trabalhos em criopreservação de gametas vêm sendo realizados nas mais diversas espécies de interesse à indústria da aqüicultura. A respeitada revisão em criopreservação de esperma de peixes relatou 185 trabalhos entre os anos de 1953 e 1996 [3].  Desde então estes números vêm aumentando.  Os grupos de peixes para os quais apresentam protocolos definidos para criopreservação de sêmen são salmões, trutas, tilápias, carpas e catfish [11]. Estes grupos já fazem parte da piscicultura brasileira, no entanto não são peixes nativos das regiões nas quais estão sendo inseridos e cultivados. A escolha do Jundiá (Rhamdia sp), justifica-se por ser uma espécie típica de distribuição geográfica definida como sul-americana [5-8] e de elevado potencial à aqüicultura regional. No entanto, para esta espécie não se tem um programa avançado de screening genético que promova um ganho significativo nos processos de melhoramento e cultivo.
 Neste sentido, a engenharia genética pode ser uma ferramenta poderosa para desenvolver e melhorar características fenotípicas de peixes para aqüicultura [7]. Podendo ser adotadas duas estratégias: (1), seleção genética através de marcadores moleculares; (2), transfecção e criopreservação gênica. Em um esforço para alcançar esta meta, a tecnologia da transgenia está sendo aplicada em várias espécies de peixe cultivadas, incluindo tilápia, truta arco-íris, salmão do Atlântico e Catfish africano [1] Porém esta nova tecnologia ainda não está disponível em países em desenvolvimento, sendo necessário estudos direcionados a esta área.
Este trabalho é parte de um projeto para a obtenção de um banco de germoplasma geneticamente modificado, visando promover um programa de melhoramento genético avançado. As técnicas de transferência gênica mediada por células espermáticas já estão sendo realizadas e aplicadas pelo grupo de pesquisa de Engenharia Genética Animal (Cenbiot / UFPel). 
O objetivo específico deste estudo foi avaliar diferentes soluções e concentrações de crioprotetores, a fim de determinar um protocolo padrão para o congelamento de células espermáticas de peixes nativos (Jundiá), dando suporte à construção do banco de germoplasma proposto.  

2.	MATERIAL E MÉTODOS

	Para a realização deste estudo foram utilizados 18 animais cultivados, fornecidos pela Estação de Piscicultura da Barragem do Chasqueiro – UFPel. Os doadores de sêmen foram selecionados e classificados de acordo com a coloração avermelhada da papila urogenital. A coleta de sêmen foi feita imobilizando e vendando os animais com toalha umedecida, evitando estresse e riscos de ferir o animal. A papila urogenital foi seca com papel toalha para reduzir o risco de possível contaminação com água, fezes ou urina e conseqüente ativação espermática. O sêmen foi aspirado com seringas graduadas (capacidade 5,0 mL) e estocados em tubos Falcon (capacidade de 15 mL) devidamente identificados. 
	As amostras foram acondicionadas e transportadas segundo a técnica de conservação a curto prozo [6].
	Os espermatozóides a fresco foram previamente classificados quanto à atividade espermática (AT) [10], sendo divididos em seis classes numa escala de 0 a 5. Esta classificação permite a análise da viabilidade espermática diante dos protocolos de criopreservação que foram submetidas às células espermáticas. 
	Amostras de sêmen foram utilizadas para aferir a osmolaridade e pH. Após a obtenção destes dados foram preparadas diferentes soluções crioprotetoras: Dimetil Sulfóxido (DMSO) a 2,5, 5, 10, 15 e 20%; Glicerol a 5, 10 e 15%; e Etilenoglicol a 5, 10 e 15%. A avaliação da toxicidade dos crioprotetores foi feita medindo-se a atividade espermática em microscópio contraste de fases (400x), em tempo real após diluição com taxas de 1:5 (sêmen: crioprotetor) [4]. 
Para o congelamento de cada amostra, o sêmen foi diluído em solução crioprotetora na proporção de 1:5 (Sêmen: Crioprotetor) e envasado em paletas (capacidade de 5mL). Cada amostra a ser criopreservada (após diferentes tratamentos) foi dividida em três alíquotas, sendo que uma foi mantida em bujão de nitrogênio líquido, a outra foi descongelada para análises pós-descongelamento, e a terceira estocada para futuro teste de fertilização in vitro. 
O congelamento foi realizado com base em protocolos já existentes para espécies exóticas, como Channel Catifish (Ictalurus punctatus), Tilápia Nilótica (Oreochromis niloticus) [4] e Carpa comum (Cyprinus carpio), alterando-se a curva de congelamento para 5ºC à 10 minutos; -20ºC à 20 minutos e –196ºC. O descongelamento foi realizado utilizando a técnica de descongelamento rápido (5 segundos a 40o C). Para a análise da atividade espermática e tempo de latência, foi utilizado solução ativadora (NaCl – 75 mOsm) em proporção de 1:10 (Sêmen criopreservado: Solução ativadora).
	Os dados foram sumarizados no programa estatístico SAS® (Statistical Analysis System), na busca de correlações significativas entre os tratamentos propostos.
3.	
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As médias de pH, osmolaridade e atividade espermática do sêmen fresco para as amostras utilizadas neste estudo foram: 7.2; 310 mOsm; e 4.2 respectivammente. 
Os resultados dos testes de toxicidade dos crioprotetores do experimento estão na Tabela 1. Dentre os crioprotetores utilizados, as diferentes concentrações de DMSO e Etilenoglicol não influenciaram significativamente a atividade espermática. No entanto, os três crioprotetores testados influenciaram significativamente o tempo de latência. Apenas as amostras diluídas em glicerol 5% demonstraram diferença significativa na atividade espermática e no tempo de latência. Observou-se que as amostras diluídas em glicerol 10 e 15%, avaliadas até o tempo de 30 minutos não apresentaram AT, portando tornando indeterminado o tempo de latência das amostras. Isto sugere que o glicerol em concentrações superior a 5% permite um maior período de manipulação das células a serem congeladas.
Todas as soluções crioprotetoras com exceção do glicerol 10 e 15% proporcionaram a ativação espermática pré-congelamento, determinando sua inviabilidade ao processo de congelamento, pois a ativação espermática promove uma fadiga celular precoce, acarretando morte celular. 

Tabela 1 - Toxicidade de crioprotetores em tempo real, avaliada com base na atividade espermática e tempo de latência (mean ± SD, N=11) para o sêmen fresco de Jundiá (Rhamdia spp.).	
Crioprotetor	Concentração %	Atividade espermática (0 a 5)	Tempo de latência (s)	
DMSO	2.5
5
10
15
20	3.90 ± 0.70a
3.81 ± 0.40a
4.36 ± 0.50a
4.00 ± 0.00a
4.00 ±  0.00a	0.00a
5.27 ± 2.93b
8.09 ± 2.73b
23.90 ± 4.10c
29.45 ± 6.36c	
Etilenoglicol	5
10
15	4.27 ± 0.46a
4.18 ± 0.40a
3.81 ± 0.60a	17.18 ± 5.09a
27.09 ± 1.51b
43.09 ± 2.02c	
Glicerol	5
10
15	3.72 ± 0.46a
0.00b*
0.00b*	493.63 ± 8.95a
indeterminada b
indeterminada b	
DMSO = dimetilsulfóxido
a-c Médias de um mesmo crioprotetor cujo superscrito contém uma letra igual são semelhantes (p<0,05).
* AT ausente à 30’ de observação;	

A partir dos dados obtidos nas análises de toxicidade foi eleito o crioprotetor glicerol nas concentrações de 10 e 15% para efetuar o congelamento espermático.
Os resultados das análises pós-descongelamento encontram-se na Tabela 2.
 
Tabela 2 – Análise espermática pós-descongelanto, avaliada com base na atividade espermática e tempo de latência (mean , N=11),  para sêmen congelado de Jundiá (Rhamdia spp.).	
Crioprotetor	Concentração %	Atividade espermática (0 a 5)	Tempo de latência (s)	
Gliceroll	10
	0.63a
	0.00
	
Glicerol	15
	0.54a
	0.00
	
a -  Médias são semelhantes (p<0,05).	

Os resultados das análises de atividade espermática pós-descongelamento demonstram não haver diferença significativa entre as médias dos tratamentos. No entanto as médias da atividade espermática apresentam-se com valores muito baixos para a fertilização e a manipulação para inserção de genes de interesse. Considerando-se que para a espécie em estudo ainda não há subsidio bibliográfico que possa auxiliar na construção de protocolos de congelamento, este trabalho proporcionará um passo inicial na determinação de alternativas para desenvolvimento destas biotécnica de manipulação de gametas.

4. CONCLUSÕES

Após observação dos resultados e suas implicações, pode-se notar que a criopreservação de sêmen de jundiá é possível, porém necessitando de mais estudos para ajustar as concentrações das soluções crioprotetoras. Dentre as soluções crioprotetoras utilizadas o Glicerol (10 e 15%) demonstrou melhor desempenho na criopreservação das células espermáticas. Outros aspectos como a curva de congelamento também devem ser avaliados, pois ainda não foram relatados para esta espécie.
Este estudo proporcionou o passo inicial à proposta de criação de um banco de germoplasma para esta espécie nativa que está sendo modificada geneticamente. 

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] COLLARES, T., AND MOREIRA, H.L.M., Peixes Transgênicos: uma tecnologia à disposição da moderna aqüicultura.  In Panorama da Aqüicultura, 2003, 13:29-35. 
[2] DESCHAMPS, J.C., LUCIA JR. T., CORRÊA, M.N., MACEDO JR, M., RHEINGANTZ, M.G.T. Otimização da eficiência do processo de produção animal a partir do uso de biotécnicas reprodutivas. Rev. Bras. Reprod. Anim., 2000, V.24, n.1, 21-29 
[3] FIGIEL, C.R. & TIERCSH, T.R. Cryopreservation methods: A review. Book of abstracts, Annual Meeting of the world Aquaculture Society, Las Vegas, Nevada, p 178., 1998
[4] GODINHO, H. P., Amorim, V.M. C., Peixoto, M. T. D. Criopreservação do Sêmen de Tilápia-Nilótica Oreochromis niloticus, var. Chitralada: R. Bras. Zootec., v.32, n.6, p.1537-1543, 2003 (Supl. 1)
[5] MALABARBA, L. R.  Histórico sistemático e lista comentada das espécies de peixes de água doce do sistema da Laguna dos Patos, Rio Grande do Sul, Brasil. Comun. Mus. Ciênc. PUCRS. Porto Alegre. Série Zool., v. 2., 1989
[6] Marques, S. Preservação a curto prazo do sêmen de teleósteos neotropicais de água doce. 2001, 98 p. Dissertação (Mestrado de Zoologia de Vertebrados), Pontifícia Universidade Católica de
Minas Gerais, 2001.
[7] MOREIRA, H.L.M. VARGAS, L., RIBEIRO, R.P., ZIMMERMANN, S. Fundamentos da moderna aqüicultura. – Canoas: Ed. ULBRA, 2001. 200p.
[8] SILFVERGRIP, A. M. C. A systematic revision of the Neotropical catfish genus Rhamdia (Teleostei, Pimelodidae). Departament of Vertebrate Zoology. Swedish Museum of Natural History. Stocholm., 1996. 
[9] SPADAFORA C. Sperm cells and foreign DNA: a controversial relation, BioEssays. (1998). 20: 955-964.
[10] STRUSSMANN, C.A., RENARD, P., LING, H., TAKASHIMA, F., Motility of pejerrey Odontesthes bonariensis spermatozoa. Fisheries Science 60, 9–13.,1994.
[11] TIERSCH, T.R & MAZIK, P.M., Cryopreservation in aquatic species. World Aquaculture Society, Baton Rouge, Lusiana, USA, p.439, 2000.