AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESPERMÁTICA DE JUNDIÁ CULTIVADO PARA UTILIZAÇÃO COMO VETOR DE GENES EXÓGENO DE INTERESSE

Menin, A*1,4 ; Cavalcanti, P.V. 1,4; Borges, C.S. 1,4; Barbieri, M. 1,4; Campos, V.F. 1,4; Roveda V.B.;  Macedo Jr. M.3,4; Collares, T. 1,4; Deschamps, J.C.3,4; Moreira, H.L.M.1,4

1Laboratório de Engenharia Genética Animal - LEGA
2 Embrapa Clima Temperado – Laboratório de Microscopia Eletrônica 
3 Laboratório de Reprodução Animal  
4 Centro de Biotecnologia – Universidade Federal de Pelotas
CenBiot - Campus Universitário s/n – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900 / RS  
E-mail: amenin_fv@ufpel.edu.br
Web: www.ufpel.edu.br/lega

1.	INTRODUÇÃO

Os processos de produção animal buscam cada vez mais eficiência e rapidez em seus resultados, visando atender as exigências de mercado, torna-se necessário à criação e aplicação de novas tecnologias que potencializem essa produção [3]. A indústria da Aqüicultura vem crescendo e sendo aprimorada nos últimos anos, através de programas que visam o aprimoramento de biotécnicas reprodutivas. Um programa de melhoramento avançado, que objetiva a produção de fenótipos específicos que acarretem ganhos genéticos nos planteis, deveriam iniciar de uma população com ampla base genética. No entanto acarreta um grande gasto de tempo, altos investimentos e sem corresponder as exigências da aqüicultura moderna. Neste sentido, a transferência de genes de interesse diminuiria significativamente o tempo do aprimoramento genético dos planteis. [7].
Apesar do progresso na obtenção de animais transgênicos em diversas espécies, o melhoramento da produção animal através da transgenia está ainda na sua infância. Somente em poucos casos a transmissão na linha germinativa (de uma geração a outra) e a expressão estável por longo tempo tem sido satisfatoriamente demonstrada. O problema principal apontado na obtenção da transmissão da linha germinal tem sido em decorrência do amplo mosaicismo do animal transgênico e ausência do transgene em células germinativas. Alguns pesquisadores apontam como causa desse mosaicismo o método utilizado para geração de transgênicos. Este, pode ser o caso em muitas espécies de peixes, uma vez que a microinjeção é feita no citoplasma do oócito e não no prónucleo masculino, devido a opacidade do gameta femino. [1]. A microinjeção em ovas envolve certas dificuldades. O núcleo não pode ser opticamente visualizado durante a fertilização das ovas. O citoplasma dos ovos de peixes apresentam uma membrana coriônica muito espessa que dificulta a entrada das micropipetas de vidro. [2]. Dentre as biotécnicas há uma que é comumente chamada de transferência gênica mediada por espermatozóides (Sperm Mediated Gene Transfer - SMGT). A definição e o estabelecimento de protocolos de trabalho para SMGT que possam ser efetivamente aplicadas a diferentes espécies animais seria de extremo valor em biotecnologia. Microinjeção de DNA requer equipamentos caros e sofisticados e uma grande habilidade manual na micromanipulação. Em adição, a tecnologia de microinjeção, apesar de ser aplicadas em ratos com sucesso, funciona bem menos eficientemente em outras espécies, como em animais domésticos e marinhos [9]. Uma alternativa lógica na geração de peixes transgênicos consiste teoricamente na introdução de DNA exógeno em células espermáticas anteriormente a fertilização artificial. A incubação de espermatozóides na presença de DNA exógeno seguido de fertilização in vivo ou in vitro tem demonstrado a geração de animais transgênicos em diferentes espécies inclusive de peixes [1].
Entre os genes que tem despertado o interesse cientifico e comercial, podemos citar o gene do hormônio do crescimento (GH), o gene da prolactina e somatolactina, o gene do fator-1 do crescimento (IGF-1), o gene da proteína anticongelante (AFP), o gene do hormônio liberador na gonadotrofina (GnRH), o gene da lisozima e o gene repórter GFP (Green Florescent Protein). [7,8].
O jundiá, (Rhamdia quelem), espécie de ocorrência na América Latina, Central e Sul do México, vêm sendo uma espécie promissora em viveiros de piscicultura, principalmente no sul do Brasil. Estudos da biologia reprodutiva de nossas espécies nativas são de fundamental importância para dar suporte a estratégias de melhoramento animal a serem empregadas [6].
Neste sentido a técnica de transferência gênica mediada por espermatozóides pode ser uma alternativa interessante na geração de peixes nativos geneticamente modificados.
Portanto, este estudo faz parte de uma etapa importante que visa determinar um perfil de atividade espermática (AT), para posterior utilização em testes de inserção de DNA exógeno. 

2.	MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção de Sêmen

Para a realização deste estudo foram utilizados 18 animais cultivados, fornecidos pela Estação de Piscicultura da Barragem do Chasqueiro – UFPel. Os doadores de sêmen foram selecionados e classificados de acordo com a coloração avermelhada da papila urogenital. A coleta de sêmen foi feita imobilizando e vendando os animais com toalha umedecida, evitando estresse e riscos de ferir o animal. A papila urogenital foi seca com papel toalha para reduzir o risco de possível contaminação com água, fezes ou urina e conseqüente ativação espermática. O sêmen foi aspirado com seringas graduadas (capacidade 5,0 mL) e estocados em tubos Falcon (capacidade de 15 mL) devidamente identificados [4].

Teste de Contaminação 

Imediatamente após a coleta,  5μL de sêmen fresco de cada peixe foram colocados no microscópio óptico de contraste fases (400x), para exame da atividade  espermática. Tendo em vista que os espermatozóides no sêmen fresco, isentos de contaminação, são imóveis, considerou-se adequado para os experimentos as amostras que exibiram taxas de atividade espermática não superiores a 0.

Acondicionamento Pré- transporte

As amostras foram acondicionadas em caixas de isopor pequenas (23 cm x18 cm x 14cm), contendo termogéis congelados (termogel atóxico, com gel a base de celulose vegetal) e armazenadas em uma caixa de isopor maior (80cm x50 cm x 58 cm) [5]. A temperatura de transporte foi mantida em média de 2 ºC, até a chegada no CenBiot – UFPel, onde foram transferidas para um refrigerador à uma temperatura de 5 ºC. 
 
	Análises Pós-transporte

As amostras foram aliquotadas para aferição de pH, omolaridade e atividade espermática (AT), sendo classificadas numa escala de 0 à 5 [10]. Para ativação espermática foi utilizada solução ativadora (SA) de NaCl – 75 mOsm,  na proporção de 1:10 (sêmen : SA), em microscópio óptico de contraste fases (400x).
  
	SMGT (Sperm Mediated Gene Transfer)

Para a transfecção de genes exógenos foi utilizado o plasmídeo comercial pGFP-N1 (30 ng/ μL). Para a inserção do DNA de interesse as células espermáticas foram submetidas a quatro tratamentos.  Diluentes de Catfish foram utilizados sobre diferentes pressões osmóticas, hiperossmótico (580 mOsm / Kg), isosmótico (310 mOsm / Kg) e hiposmótico (149 mOsm/Kg), na diluição seminal. As amostras seminais foram submetidas a 3 tratamentos de inserção de DNA exógeno: Tratamento 1: desidratação, reidratação e eletroporação espermática (capacitance 3.0V, resistance 200 ohms, voltage 2.5 kV). Tratamento 2: desidratação e Reidratação  espermática. Tratamento 3: eletroporação em solução isosmótica. Tratamento 4: controle (sêmen fresco + DNA exógeno). Foram utilizados  para cada tratamento o ejaculado de dois machos elites e um pool de sêmen destes dois machos.

	Análise da atividade pós- SMGT

Após a utilização das técnicas de inserção de DNA exógeno, as células espermáticas foram submetidas a análises de AT em microscópio óptico de contraste fases (400x), para determinação da viabilidade espermática. 

	Analise Estatística	

Os dados foram sumarizados no programa estatístico SAS® (Statistical Analysis System), na busca de correlações significativas entre os tratamentos propostos.

3.	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Teste de Contaminação
 
	Durante o processo de coleta de sêmen ocorreram contaminações de 16% das amostras, sendo descartadas 3 amostras. 

Análise pré-transporte e pós-transporte da Atividade espermática
	
	A média e o desvio padrão referentes à atividade espermática durante o período de acondicionamento e transporte do sêmen estão representados na Tabela1, onde se observa queda significativa na AT e no TPA, provavelmente influenciadas pelo sistema de transporte. No entanto estes dados possibilitam a manipulação das células espermáticas para a introdução de DNA exógeno e proporcionam uma logística determinante aos padrões de biossegurança, visto que as células espermáticas devem ser manipuladas em ambiente controlado e regulamentado (CenBiot – UFPel). 

Tabela1- Análise avaliada com base na atividade espermática e tempo de latência (mean ± SD, N=15) para o sêmen fresco de Jundiá (Rhamdia spp.), pré e pós-transporte.	
Análise	Atividade espermática (0 a 5)	Tempo de permanência em atividade (s)	
Pré-transporte	4.53 ± 0.63a	71.06 ± 49.04a	
Pós-transporte	3.46 ± 0.51b	57.86 ± 12.14b	
a, b diferiram significativamente para a mesma coluna; p<0,05	

SMGT (Sperm Mediated Gene Transfer) e análise da atividade pós-SMGT

As técnicas de introdução de DNA exógeno utilizadas não foram avaliadas neste estudo, visto que o objetivo deste trabalho foi de determinar a influencia das técnicas sobre a AT, que determinam o potencial do sêmen geneticamente manipulado e sua viabilidade para futuras fertilizações. Os dados estão descritos na Tabela 2.

Tabela2- Análise da atividade espermática pós tratamentos de transfecção de DNA exógeno. (mean ± SD, N=15) para o sêmen fresco de Jundiá (Rhamdia spp.), pós-SMGT.	
Análise	Atividade espermática (0 a 5)	
T1	3.00± 0.00a	
T2	3.66 ± 0.57 a	
T3	3.33 ± 0.57 a	
Controle	4.00 ± 0.00 a	
Média Geral	3.56 ± 0.40 a	
a não diferiram significativamente para a mesma coluna; p>0,05	

Como pode ser observado na tabela acima, as médias para os tratamentos de transfecção espermática não diferiram significativamente quanto a AT. Pode-se considerar também como dado relevante, o fato das taxas de AT não terem sido influenciadas pelos tratamentos, demonstrando a viabilidade espermática do sêmen de jundiá como um vetor em potencial de  transferência de DNA exógeno na construção de Jundiás transgênicos. 

4. CONCLUSÕES

O sêmen de Jundiá suporta transporte em temperaturas médias de 2 ºC e manipulações de diferencial osmótico e/ou eletroporação, sem perder qualitativamente sua potencialidade espermática, permanecendo em parâmetros aceitáveis para o processo de fertilização.
Considerando que este trabalho faz parte de um projeto amplo e pioneiro na área de transgenese animal no Brasil, constatou-se o elevado potencial espermático desta espécie, como modelo biológico para engenharia genética.  

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] COLLARES, T., AND MOREIRA, H.L.M., Peixes Transgênicos: uma tecnologia à disposição da moderna aqüicultura.  In Panorama da Aqüicultura, 2003, 13:29-35.
[2] COLLARES, T., MACEDO JR, M., MENIN, A., BRITO, D., MANSKE, V,H,B., BASTOS,R., MOREIRA, H,L,M., DELLAGOSTIN, O., DESCHAMPS, J,C. Evaluation of sperm activity of Rhamdia quelen ( JUNDIÁ) after diferent treatments to insert foreign DNA. Anais...: 15th International Congress on Animal Reproduction, 2004, V. 2, 527. 
[3] DESCHAMPS, J.C., LUCIA JR. T., CORRÊA, M.N., MACEDO JR, M., RHEINGANTZ, M.G.T. Otimização da eficiência do processo de produção animal a partir do uso de biotécnicas reprodutivas. Rev. Bras. Reprod. Anim., 2000, V.24, n.1, 21-29 
[4] GODINHO, H. P., Amorim, V.M. C., Peixoto, M. T. D. Criopreservação do Sêmen de Tilápia-Nilótica Oreochromis niloticus, var. Chitralada: R. Bras. Zootec., v.32, n.6, p.1537-1543, 2003 (Supl. 1)
[5] Marques, S. Preservação a curto prazo do sêmen de teleósteos neotropicais de água doce. 2001, 98 p. Dissertação (Mestrado de Zoologia de Vertebrados), Pontifícia Universidade Católica de
Minas Gerais, 2001.
[6] Menin, A.; Collares, T; Ferreira Filho, E. B.; Britto, D; Deschamps, J.C.; Moreira, H.L.M. Efeito do diferencial osmótico sobre a atividade espermática de reprodutores de Jundiá (Rhamdia quelem) cultivados. Anais...:V Enpos e XII CIC – UFPel, 2003.
[7] MOREIRA, H.L.M. VARGAS, L., RIBEIRO, R.P., ZIMMERMANN, S. Fundamentos da moderna aqüicultura. – Canoas: Ed. ULBRA, 2001. 200p.
[8] SHEARS, M.A., G.L. FLETCHER, C.L. HEW, S. GAUTHIER, P.L. DAVIES, Transfer, expression, and stable inheritance of antifreeze protein genes in Atlantic salmon (Salmo salar), Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (1991)58–63.
[9] SPADAFORA C. Sperm cells and foreign DNA: a controversial relation, BioEssays. (1998). 20: 955-964.
[10] STRUSSMANN, C.A., RENARD, P., LING, H., TAKASHIMA, F., Motility of pejerrey Odontesthes bonariensis spermatozoa. Fisheries Science 60, 9–13.,1994.