DESINFESTANTE E SACAROSE NO ESTABELECIMENTO IN VITRO DE SEMENTES DE ROMÃ (Punica granatum L.)1

Picolotto, L. 2*; Schuch, M. W. 3; Souza, J. A.4; Silva, L. C.2; Ferri, J.5; Fachinello, J.C.6

1 Laboratório de Micropropagação de Plantas Frutíferas; Apoio MCT-CNPq, FAPERGS
2 Alunos de Mestrado do PPGA, área - Fruticultura de Clima Temperado. FAEM/UFPEL. lpicolotto@universiabrasil.net; lucianecouto@yahoo.com.br.
3 Profa. Dra. Departamento de fitotecnia, FAEM/UFPel, marciaws@ufpel.tche.br
4 Doutoranda do PPGA, área - Fruticultura de Clima Temperado. FAEM/UFPEL. joseas@ufpel.tche.br
5 Graduanda em Agronomia, Bolsista PIBIC/CNPQ-UFPel. juferri@pop.com.br 
6 Prof. Dr. Departamento de fitotecnia, FAEM/UFPel, jfachi@ufpel.tche.br
1. INTRODUÇÃO
A romãzeira (Punica granatum L.), pertencente à família Punicaceae, tem sido utilizada como planta frutífera, ornamental e também reúne propriedades medicinais.
É propagada por sementes, mas como tem polinização cruzada pode ocorrer variabilidade, porém, a propagação vegetativa por estacas lenhosas, bem como por alporquia é de fácil realização [2]. Outra maneira de propagação vegetativa que pode ser utilizada é o cultivo in vitro, no entanto este método apresenta inconvenientes como a contaminação e oxidação dos explantes.
 Existem diversos fatores como tipo de desinfestante, procedência do explante inicial e fonte de carboidrato no meio de cultivo, que pode favorecer ou controlar a incidência de contaminantes microbianos. Além disso, várias substâncias com ação germicida são utilizadas para fazer a desinfestação dos explantes. Os mais comuns são o etanol, geralmente utilizado a 70% e 80%, e os compostos a base de cloro, tais como hipoclorito de sódio e de cálcio [5].
A ação germicida das soluções de hipoclorito é devida a sua alta capacidade oxidante, que destrói a atividade das proteínas celulares. As combinações dos princípios ativos desinfestantes e os tempos de exposição variam muito.
O desenvolvimento de sistemas de micropropagação fotoautotrófica, isto é, a produção de micropropágulos sem adição de sacarose no meio de cultura e sob condições ambientais que promovam a fotossíntese na planta, surgem como possibilidades que apresentam o potencial de aumentar a eficiência e reduzir os custos, viabilizando a micropropagação comercialmente, além disso o cultivo em meio sem sacarose apresenta a vantagem do baixo risco de contaminação [6; 7].
Desta forma, este trabalho teve como objetivo identificar um protocolo para desinfestação de sementes de romã e verificar o efeito da sacarose na contaminação microbiana.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
O trabalho foi realizado no Laboratório de Micropropagação de Plantas Frutíferas, Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, da Universidade Federal de Pelotas, RS.
Os tratamentos constituíram-se de dois tipos de soluções desinfestantes (hipoclorito de sódio e hipoclorito de cálcio), diferentes concentrações destas soluções desinfestantes (1; 2; 3 e 4%) e meio de cultura MS (MS normal e MS sem sacarose), totalizando 16 tratamentos. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com quatro repetições por tratamento. Cada repetição constituiu-se de cinco tubos de ensaio com um explante.
	As sementes foram desinfestadas em câmara de fluxo laminar onde o material foi colocado em álcool 70% por 10 segundos, seguindo pela imersão em uma solução de hipoclorito de sódio ou cálcio nas diferentes concentrações utilizadas, pelo período de 10 minutos e após lavadas por três vezes em água destilada e autoclavada. 
	O meio de cultura utilizado foi o MS [8], acrescido ou não de sacarose, sendo o pH ajustado para 5,8 antes da inclusão do ágar na concentração de 6gL-1 e, posteriormente, autoclavado a 121ºC e 1,5atm por 20 minutos. Foram utilizados tubos de ensaio com 10 mL de meio de cultura. 
	Após a inoculação, as sementes permaneceram no escuro por um período de 7 dias, visando diminuir a oxidação fenólica. Em seguida foram transferidos para sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas luz, temperatura de 25  2ºC e densidade de fluxo de fótons do período de luz de 27molm-2s-1.
	Aos 7, 14, 21, 28 e 35 dias de cultivo avaliou-se a porcentagem de contaminação fúngica e bacteriana além da porcentagem de explantes oxidados. 
	Os dados foram submetidos à análise de variação e as médias dos tratamentos comparadas estatisticamente pelo teste de Duncan, através do uso do programa estatístico SANEST [9]. Os dados em porcentagem foram transformados em arco seno da raiz quadrada de x/100, onde x é o percentual obtido.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para a variável percentagem de contaminação bacteriana, a análise de variância permitiu verificar que houve interação entre os tipos de desinfestantes, concentração e meio de cultura. De acordo com teste de Duncan em meio sem sacarose e em varias concentrações de desinfestantes o hipoclorito de sódio foi mais eficiente que o hipoclorito de cálcio (Figura 01). Resultados semelhantes foram encontrados em trabalhos com quatro procedimentos de desinfestação no estabelecimento in vitro de mirtilo, sendo eles, álcool + hipoclorito de cálcio, hipoclorito de cálcio, álcool + hipoclorito de sódio, e hipoclorito de sódio, e concluíram que o procedimento de desinfestação mais eficiente foi aquele onde se utilizou apenas o hipoclorito de sódio a 1,5% de cloro ativo [2]. 
Na contaminação fúngica a análise de variância permitiu verificar diferenças altamente significativas (α = 0,01) com interação entre tipo de desinfestante, concentração e meio de cultura. Em meio MS com sacarose o desinfestante mais eficiente foi o hipoclorito de sódio em concentração de 1% com contaminação de 20% (Figura 03). Em trabalho realizado com sementes de Apuleia leiocarpa não houve registros de contaminação utilizando hipoclorito de sódio [4]. 
Verificou-se que no meio MS sem sacarose os níveis de contaminação fúngica foram baixos (19,5%) no hipoclorito de sódio a 4%, o que esta de acordo com o esperado, já que a concentração da solução desinfestante é inversamente proporcional a contaminação [1]. Na concentração de 2%, o hipoclorito de cálcio, em meio MS normal, proporcionou contaminação fúngica de 34,19%, semelhante aos 21,97% encontrado em trabalho realizado com desinfestação de explantes de porta enxertos .
		
Figura 01: Percentagem de contaminação bacteriana em meio de cultura sem sacarose observada nas sementes de romã aos 14, 28 e 35 dias de cultivo in vitro
Letras diferentes nas datas de avaliações, diferem entre si pelo teste de Duncan a 5%.	Figura 02: Percentagem de oxidação em sementes de romã em meio de cultura sem sacarose em função dos desinfestantes de 7 a 35 dias de cultivo in vitro. 
Letras diferentes nas datas de avaliações, diferem entre si pelo teste de Duncan a 5%.	

A

B

b

Figura 03: Percentagem de contaminação fúngica observada nas sementes de romã em meio de cultura sem (A) e com sacarose (B) em diferentes concentrações de desinfestantes.
Letras diferentes nos tipos de desinfestantes, diferem entre si pelo teste de Duncan a 5%.	
Para a percentagem de oxidação houve interação entre tipo de desinfestante e meio de cultura. Em meio sem sacarose o hipoclorito de cálcio apresentou maior oxidação que o de sódio. De modo geral tanto para o hipoclorito de sódio e de cálcio a oxidação foi baixa (Figura 02). Resultados semelhantes foram encontrados, com os mesmos desinfestantes, em trabalho realizado com desinfestação de explantes de porta enxertos Mr.S 2/5, OKinawa e Mr.S 1/8 nas concentrações de 0,5%, 1%,1,5% e 2%, onde não foi verificada a ocorrência de oxidação fenólica [1].
4. CONCLUSÕES
	Em meio MS sem sacarose a concentração de 3 e 4% de hipoclorito de sódio apresentou menor contaminação microbiana. 
	A oxidação das sementes foi menor quando utilizou-se meio MS sem sacarose e hipoclorito de sódio como desinfestante.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
[1]CHAVES, C.A. da; SCUCH, M. M.; FACHINELLO, J. C. influencia de diferentes concentrações de soluções desinfestantes no estabelecimento in vitro de explantes de Prunus. Revista Científica Rural, v. 8, n. 2, p. 153-161, 2003.
[2] DONADIO, L. C.; NACHTIGAL,  SACRAMENTO, C. K. Frutas exóticas. Jaboticabal: Funepe, 1998. 279p. 
[3] ERIG, A. C.; VICENZI, M.; CHAVES, A. C.; SCHUCH, M. W.; FACHINELLO, J. C. Desinsfestação de explantes de mirtilo (Vaccinium ashei Reade) visando o estabelecimento de plantas in vitro. Revista Científica Rural, Bagé, v. 8, n. 1, p. (prelo), 2003.
[4]GONDIM, L.C.; MENDALHA, A. B.L.; TORRES, R.A.A.; BLUMENSCHEIN, A. Micropropagação de Apuleia leiocarpa (GARAPA) in vitro. In: Encontro latino americano de biotecnologia vegetal, 2001. Goiânia GO. Programa e resumos...Goiânia: Red Bio, 2001, p. 114.
[5] GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, 1998. p. 183-260.
[6] KOZAI, T.; KUBOTA, C. Developing and photoautotrophic micropropagation system for woody plants. Journal of Plant Research, v. 114, p. 525-537, 2001.
[7}KUBOTA, C.; TADOCORO, N. Workshop on bioreactor technology control of microbial contamination for large-scale photoautotrophic micropropagation. Society for In Vitro Biology, v. 35, p. 296-298, 1999.
[8] MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossay with tabacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Kobenhavn, v. 15, p.473-497, 1962.
[9] ZONTA, E. P.; MACHADO, A. A. SANEST – Sistema de análise estatística para microcomputadores. Pelotas: DMEC/IFM/UFPel, 1987. 138p.