EFEITO DA LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE DA GEMA DO OVO SOBRE A QUALIDADE DO SÊMEN CANINO RESFRIADO A 5ºC
Corcini, C.D.1*; Varela Junior, A. S.1; Ulguin R.R.1; Bianchi, I.1; Alvarenga M.V.F.1; Lucia, T.Jr.1, 2; Deschamps, J.C.1, 2; Corrêa, M.N.1, 3 
1 PIGPEL – Centro de Biotecnologia, Faculdade de Veterinária 
2 Departamento de Patologia Animal, Faculdade de Veterinária
3 Departamento de Clínicas Veterinária, Faculdade de Veterinária
Campus Universitário s/n – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas/RS.
* ccorcine.fv@ufpel.edu.br   www.ufpel.edu.br/pigpel

APOIO : FAPERGS – Fundação de Amparo a Pesquisa e Ensino do Rio Grande do Sul

INTRODUÇÃO
	Nas últimas duas décadas tem aumentado a utilização de sêmen diluído e resfriado para a utilização na inseminação artificial em cães. Diferentes tipos de diluentes foram avaliados para preservar o espermatozóide [3, 6]. Os diluentes que apresentaram melhores resultados na preservação do espermatozóide canino a 5ºC são acrescidos de gema de ovo [6], sendo esta a responsável por proteger a célula espermática contra o choque térmico [9]. Foi sugerido por diversos autores que a fração lipoprotéica de baixa densidade (LDL) presente na gema é a responsável pelo efeito crioprotetor durante os processos de congelamento e resfriamento dos espermatozóides de mamíferos [2, 5, 14, 16], em função das lipoproteínas associarem-se com a membrana espermática [17, 18], prevenindo a perda de fosfolipídios [2, 12] e colesterol [2] estabilizando, desta forma, a membrana. Entretanto, na gema de ovo, existem substâncias que inibem a respiração mitocondrial e motilidade [11, 15]. A substituição da gema do ovo pela LDL pode trazer benefícios na qualidade das doses inseminantes, já que a LDL tende a melhorar as características qualitativas espermáticas, quando comparado com diluentes contendo a gema de ovo integral [1, 2, 8, 10].
Este trabalho avalia o efeito da substituição da gema de ovo pela LDL, em três concentrações (6, 8 e 10%), no diluente Tris-Glucose, sobre a qualidade do sêmen canino acondicionado à 5ºC.

MATERIAIS E MÉTODOS
Purificação da LDL da gema de ovo:
Primeira Etapa – Os ovos foram quebrados manualmente e as gemas separadas das claras. Cada gema foi colocada sobre um papel filtro para remoção da chalaça e traços de clara aderida à membrana vitelínica. Esta foi rompida e a gema coletada em um Becker resfriado em gelo.
Segunda Etapa – Separou-se a fração plasmática da gema, método descrito por McBee e Cotterill [9], onde a gema de ovo é diluída duas vezes com solução salina isotônica (0,17 M NaCl) e misturada por uma hora. Posteriormente é centrifugada por 45 minutos à 4ºC por 10.000 x g, e o sobrenadante é centrifugado novamente para remover completamente os grânulos.
Terceira Etapa – Extração da LDL do plasma da gema do ovo, técnica descrita por Moussa [10], o plasma é misturado com o Sulfato de amônia à 40% por 1 hora para precipitar, o pH é fixado e controlado a 8,7 e a temperatura à 4º C. Em seguida é centrifugado a 10.000 x g por 45 minutos à 4ºC e o sobrenadante residual, rico em LDL, é coletado para ser dializado por pelo menos 6 horas com água destilada, para eliminar o sulfato de amônia. Após, é centrifugado a 10.000 x g por 45 minutos e o sobrenadante residual, rico em LDL, é coletado.
Preparação dos diluentes: Foi utilizado como diluente base o Tris Glucose(TG) [6] que é composto de tris hidroximetil aminometano (3,025g), Acido cítrico (1,7g), glicose (1,25g), benzilpenicilina (100mg), sulfato de dihidrostreptomicina (100mg) e diluído em água destilada e deionizada. Com um pH e osmolalidade de 6,9 e 380 mOsm, respectivamente. A diferença entre os diluentes foi determinada pela adição de 40% de gema de ovo (controle), 12, 16 e 20% de LDL da gema de ovo e estas concentrações foram determinadas considerando o fato de que, no momento desta diluição, as células espermáticas estarão diluídas em uma fração de TG puro que será adicionada a cada um dos diluentes numa proporção de 1:1, reduzindo a concentração destes componentes aos valores desejados (20% gema de ovo, 6, 8 e 10% LDL).
Animais e coleta seminal: No presente estudo foram utilizados 4 cães adultos da raça Cocker Spaniel. O sêmen foi coletado através de manipulação digital [3], em tubos cônicos graduados sendo coletado as três frações do ejaculado separadamente, respeitando um intervalo mínimo de uma semana entre as coletas e totalizando 5 coletas para cada animal (20 ejaculados). Durante a coleta, somente a segunda fração do ejaculado, rica em espermatozóides, foi retida tendo suas características macroscópicas (aspecto, volume e cor) avaliadas logo após cada coleta, e em seguida, sua motilidade e vigor avaliados sendo separada amostra para avaliação morfológica posterior, os ejaculados que apresentaram valores inferiores a 80% de motilidade e vigor 4 foram descartados.
Processamento seminal: Cada ejaculado foi diluído em igual volume de TG puro em condições isotérmicas. As frações diluídas foram submetidas à centrifugação a 800 RPM por 5 minutos para separação do plasma seminal e o pellet de células espermáticas novamente diluído em 6 ml de TG puro, sendo em seguida avaliado sua motilidade e vigor e coletado amostra para avaliação morfológica. Este total é dividido em quatro alíquotas de 1,5 ml, destinadas à diluição de 1:1 em cada um dos quatro diluentes, obtendo assim as concentrações desejadas de gema de ovo e LDL (20% gema e 6,8,10% LDL ). Para o resfriamento as amostras foram estabilizadas à 25ºC por 2 h e em seguida resfriadas à 5º C.
Avaliação da qualidade espermática: As avaliações realizadas no sêmen diluído e resfriado tiveram o objetivo de estimar o desempenho do diluente TG frente à substituição da gema do ovo pela LDL em diferentes concentrações. Foram realizadas avaliações de motilidade [13], morfologia espermática [4] e teste do Choque Hipoosmótico – CHIPO [7], sendo estas repetidas a cada 24h pelo período de 96 h, e as avaliações de motilidade continuaram sendo repetidas até que fossem encontrados valores inferiores a 50% de motilidade para a avaliação do tempo Maximo de Duração (MD) de cada amostra.
Análise estatística: Foram geradas estatísticas descritivas e distribuições de freqüências. Também foi realizada análise de variância com medidas repetidas e feita a comparação entre médias através do teste LSD, através do programa STATISTIX (2004).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Durante os 4 períodos, a avaliação da Motilidade (MOT) no tratamento Tris-Glucose com 20% de gema de ovo (T1) foi menor (P<0.01) que os tratamentos Tris-Glucose com 6, 8 e 10% de LDL (T2, T3 e T4 respectivamente), mas a MOT não diferiu (P>0.05) entre estes 3 tratamentos (Tabela 1). A integridade de membrana foi inferior no T1 (P<0.01) quando comparada aos T2 e T3 em todos os períodos e também foi inferior ao T4 (P<0.01) nas 24, 48 e 96 h (Tabela 2), mas T2, T3 e T4 não diferiram entre si (P>0.05). 
A duração máxima de T1, T2, T3 e T4 foram de 152,6, 204,4, 212,1 e 200,6 horas sendo que T2, T3 e T4 não diferiu entre si (P>0.05), mas T1 foi inferior (P<0.01) em relação a estes tratamentos. 

Tabela 1: Motilidade espermática (%) do sêmen canino por tratamento e período de estocagem
Tratamentos	0 h	24 h	48 h	72 h	96 h	
TG com 20% de gema de ovo	87.0a	79.0a	73.7a	68.2a	61.5a	
TG com 6% de  LDL	86.5a	83.5b	83.0b	76.5b	70.5b	
TG com 8% de LDL	88.5a	86.5b	83.5b	81.5b	75.5b	
TG com 10% de LDL	87.0a	83.5b	81.7b	76.5b	70.0b	
Letras diferentes, na mesma coluna, representam diferença (P<0,01).

Tabela 2: Médias da Integridade de membrana do sêmen canino por tratamento e período de estocagem
Tratamentos	24 h	48 h	72 h	96 h	
TG com 20% de gema de ovo	46.2a	43.9a	42.7a	35.0a	
TG com 6% de  LDL	62.6b	57.0b	54.2b	45.3b	
TG com 8% de LDL	59.1b	55.0b	54.0b	47.0b	
TG com 10% de LDL	57.3b	54.0b	49.4ab	45.1b	
Letras diferentes, na mesma coluna, representam diferença (P<0,01).

Estes resultados demonstraram que a LDL pode substituir a gema de ovo, no diluente TG para diluição de sêmen canino, pois teve melhores resultados na motilidade, integridade de membrana e no tempo de duração máxima, resultados obtidos também nas espécies bovina [10] suína [5] e ovina [18]. Desta forma podemos afirmar que a utilização da LDL purificada em substituição a gema integral é benéfica para o acondicionamento de sêmen destas espécies. 
Devido à temperatura ser de 5C, pode utilizar refrigeradores domésticos, difundindo ainda mais a utilização da inseminação artificial em clínicas veterinárias de pequenos animais.	
Já em relação à morfologia não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos (Tabela 3).

Tabela 3: Médias de espermatozóides normais na morfologia do sêmen canino por tratamento e período de estocagem.
Tratamentos	24 h	48 h	72 h	96 h	
TG com 20% de gema de ovo	87.0	85.7	84.6	83.4	
TG com 6% de  LDL	87.3	85.9	85.0	83.3	
TG com 8% de LDL	88.8	87.9	86.7	85.3	
TG com 10% de LDL	87.7	86.6	86.2	84.1	
Não houve diferença nos valores dentro da mesma coluna (P>0,05).

CONCLUSÃO
Estes resultados demonstraram que a substituição da gema do ovo integral pela LDL nas concentrações de 6, 8 e 10%, adicionado ao diluente Tris-Glucose, melhora a qualidade do sêmen canino resfriado a 5°C por até 96h.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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