ELISA INDIRETO PARA DETECÇÃO DE ENTEROTOXINAS C2 
E D PRODUZIDAS POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Zocche, F.1*; Nalério, E.S.1,3; Moreira, A.N.2; Aleixo, J.A.G.2; Silva, W.P.1

1 Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Agroindustrial, DCTA, FAEM, UFPEL
2 Laboratório de Imunologia Aplicada, Centro de Biotecnologia, UFPEL
3 Bolsita de Iniciação Científica PIBIC/CNPq
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Campus Universitário, caixa postal 354, CEP 96010-900, Pelotas, RS, zocche@ufpel.edu.br

1. INTRODUÇÃO

A multiplicação de Staphylococcus aureus em alimentos representa um potencial perigo à saúde pública [9], podendo causar intoxicação alimentar, uma doença que, na maioria das vezes, é provocada pela ingestão de alimentos contendo enterotoxinas estafilocócicas (EE) pré-formadas [7].
As EE são proteínas extracelulares de baixo peso molecular (25.000 a 30.000 daltons), hidrossolúveis, com composição de aminoácidos, estrutura molecular e atividades farmacológicas semelhantes entre si, possuindo, entretanto, propriedades imunológicas distintas [12], e quando ingeridas, podem causar náuseas, vômitos, dores abdominais e diarréia [2,16]. Cinco tipos clássicos de EE (EEA a EEE) e 15 novos tipos (EEG a EEU) já foram descritos [1,2,16]. Além disso, EEC subdivide-se em três tipos: EEC1, EEC2 e EEC3 [2,3,6]. Casos esporádicos e surtos [4] envolvendo EE clássicas freqüentemente são relatados, ao passo que para os novos tipos de EE identificados o envolvimento com intoxicação alimentar não está ainda bem esclarecido [16].
A determinação do tipo de EE é um fator importante na elucidação de casos e surtos de doenças alimentares [9] e sua presença sugere uma possível fonte de contaminação de alimentos [11]. Dentre os métodos para a detecção de enterotoxinas incluem-se imunodifusão, radioimunoensaios e ensaios imunoenziomáticos (ELISA) [13], sendo que uma grande variedade de ELISA tem sido descritos para a detecção de EE [15]. Atualmente são encontrados kits comerciais (VIDAS Staph enterotoxin SET kit, Staphylococcal Enterotoxin Test Kit; ELISA test Kit; SET-RPLA) disponíveis para a detecção direta de EE, no entanto, o custo elevado destes kits de diagnóstico cria dificuldades e inviabiliza seu uso na rotina laboratorial.
A detecção direta de enterotoxinas requer o desenvolvimento de ensaios práticos, rápidos e sensíveis. Nesse sentido objetivou-se desenvolver e avaliar um ELISA indireto para a detecção de EEC2 e EED produzidas por Staphylococcus aureus e determinar o tipo de EE produzida por 10 cepas de S. aureus isoladas de vacas com mastite subclínica da região de Pelotas, RS.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Para a padronização do ELISA foi utilizada uma cepa padrão não produtora de enterotoxinas (Staphylococcus warneri – Maringá 033-0), enterotoxinas purificadas e soros padrões antitoxinas preparados em coelho (cedidos pela Fundação Ezequiel Dias, MG), um conjugado composto de anticorpo de suíno anti-imunoglobulina de coelho ligado a peroxidase e uma solução bloqueadora a base de fluido ascítico produzido em camundongo por hibridoma secretor de IgG2b. Diferentes concentrações das EE diluídas em sobrenadante de um cultivo de S. warneri em BHI (caldo infusão cérebro coração) dupla concentração adicionado de 1% de extrato de levedura foram utilizadas para sensibilizar poços de placas de ELISA por 1 hora a 37ºC. Após a sensibilização as placas foram lavadas 3 vezes com solução tamponada detergente de pH neutro (NaCl - 8,0%; KH2PO4 - 0,2%; Na2HPO4 anidro - 1,15%; KCl - 0,2%, Tween 20 – 0,05%; (PBST) e bloqueadas por 1 hora a 37ºC com fluido ascítico diluído 1:20 em PBST. Repetiu-se a lavagem e adicionou-se diferentes concentrações dos soros antitoxina diluídos em PBST e incubou-se 1 hora a 37ºC. Nova lavagem foi feita e o conjugado diluído 1:1000 em PBST foi adicionado. Após incubação por 1 hora a 37ºC as placas foram lavadas 5 vezes, o substrato cromógeno foi adicionado, deixando reagir por 15 minutos. Ao final da reação a absorbância foi lida em um leitor de placa a 450nm.
Após a padronização, 10 isolados de campo de S. aureus foram testados quanto à produção de EE. Sobrenadante de cultivos em BHI dupla concentração, adicionado de 1% de extrato de levedura, incubados durante 24h/35C, foram submetidos à pesquisa de enterotoxinas através do ELISA. Como controles foram utilizados as cepas padrão S. aureus FRI 361, produtor de enterotoxina C2, S. aureus  FRI 472, produtor de enterotoxina D e S. warneri – Maringá 033-0, não produtor de enterotoxina.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os limites de detecção das enterotoxinas obtidos durante a etapa de padronização do ELISA foram de 60 pg.mL-1 para EEC2 e 30 pg.mL-1 para EED.
Do total de isolados, 100% eram enterotoxigênicos e produziram uma ou mais EE (Tab.1), com 90% produzindo as duas enterotoxinas e 100% produzindo EED (Fig.1).

Tabela 1:  Isolados  de  S.  aureus  e 
respectivas enterotoxinas produzidas
Isolado	Enterotoxina	
3	C2 e D	
8	D	
9	C2 e D	
12	C2 e D	
15	
Isolados produtores de enterotoxina D

C2 e D	
16	
Isolados produtores de enterotoxina C2 + D

C2 e D	
17	C2 e D	
18	
Figura 1: Percentuais de isolados de S. aureus produtores de enterotoxinas D e C2+D.

C2 e D	
19	C2 e D	
24	C2 e D	

Diversos trabalhos [5,6,10] reportam a presença de cepas enterotoxigênicas de S. aureus em leite e/ou em animais mastíticos. Diversas explicações para os elevados percentuais encontrados de cepas de S. aureus enterotoxigênicos nesse tipo de amostra têm sido sugeridas sendo uma delas a diversidade dos isolados e de suas origens [5]. Atualmente tem-se demonstrado que EEA e EEB são associadas com contaminação humana e que EEC e EED são associadas com contaminação animal (bovinos e suínos) [11]. Essa afirmação pode explicar o alto índice de cepas produtoras de EEC2 e EED encontrados neste estudo, uma vez que todas foram isoladas em bovinos. Outro trabalho que corrobora a informação supracitada é o de CENCI-GOGA et al. [5], que, analisando 160 isolados de S. aureus originários de vacas mastíticas, não encontraram nenhuma cepa produtora de EEA e EEB, ao passo que 4,4%, 7,5% e 1,9% das cepas foram produtoras de EEC, EED e EEC + EED, respectivamente.
Os melhores métodos imunoenzimáticos para identificação de EE dependem da disponibilidade de anticorpos específicos para cada tipo de enterotoxina [13], podendo apresentar significativas variações na sensibilidade e especificidade de acordo com a pureza dos reagentes e com os níveis de expressão das EE [8]. O método utilizado para detectar a produção de enterotoxinas de S. aureus pode influenciar os resultados encontrados. ORDEN et al. [14], trabalhando com ELISA e immunoblot encontraram 56,8% e 54,3%, respectivamente, de cepas produtoras de EEC. IGARASHI et al., 1986 apud BERGDOLL [3], trabalhando com o gênero Staphylococcus detectaram enterotoxinas através do método da aglutinação passiva em látex (RPLA) não obtendo os mesmos resultados trabalhando com o método OSP (optimum sensitivity plate) e BERGDOLL [3] encontrou isolados do gênero que produziram EE envolvidas em surtos e que foram detectadas pelo ELISA, mas não pelo método OSP.

4. CONCLUSÃO

O ELISA descrito tem sensibilidade suficiente para ser utilizado na detecção e quantificação de enterotoxinas em sobrenadante de isolados de Staphylococcus aureus. Do total de isolados analisados, 90% produziu EEC2 e 100% produziu EED.

5. AGRADECIMENTOS
Doutor Luiz Simeão do Carmo – FUNED; Doutora Tereza Cristina Rocha Moreira de Oliveira - Universidade Estadual de Londrina. CNPq.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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[3] BERGDOLL,M. Analytical methods for Staphylococcus aureus. International Journal of Food Microbiology, v. 10, p.91-100, 1990.

[4] CARMO,L.S., DIAS,R.S., LINARDI,R., SENA,M.J., SANTOS,D.A., FARIA, M.E., PENA, E.C., JETT, M., HENEINE, L.G. Food Poisoning due to enterotoxigenic strains of Staphylococcus present in Minas cheese and raw milk in Brazil. Food Microbiology, v. 19, p. 9-14, 2002.
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[6] CHEN, T.R., CHIOUB, C.S., TSEN, H.Y. Use of novel PCR primers specific to the genes of staphylococcal enterotoxin G, H, I for the survey of Staphylococcus aureus strains isolated from food-poisoning cases and food samples in Taiwan. International Journal of Food Microbiology v.92, p. 189– 197, 2004.

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[11] NÁJERA-SANCHEZ,G.,RODRIGUEZ,R.M.,OLVERA,P.R.,GARZA,L.M. Development of two multiplex polymerase chain reactions for the detection enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus isolated from foods. Journal of Food Protection, v. 66, p.1055-1062, 2003.

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