IDENTIFICAÇÃO DE TOMATEIROS RESISTENTES E SUSCETÍVEIS A GEMINIVÍRUS VIA RAPD

Karnopp, L.M.1*; Andrade, P.P.1

1Laboratório de Genética Molecular, Depto. de Genética, UFPE, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, Cidade Universitária, 50670-901 Recife – PE
*loiva@pop.com.br; loivamaria@bol.com.br

1. INTRODUÇÃO
O processamento de tomate é um dos segmentos mais importantes da agroindústria brasileira. Dos 60 mil hectares de tomateiro cultivados, cerca de 40% são destinados a indústria. O valor global de mercado foi de US$800 milhões na virada do milênio [4]. O tomate é a hortaliça com maior volume de comercialização no Brasil – 3 milhões de toneladas/ano [6].  As principais áreas de produção encontram-se nas Regiões Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste [3]. Um fator limitante no cultivo do tomateiro são as doenças viróticas, principalmente, devido à dificuldade de controle [7]. A família Geminiviridae possui alguns dos fitovírus de maior importância econômica no Brasil e no mundo. Os geminivírus são considerados vírus emergentes devido ao aumento da incidência e severidade das doenças por eles causadas nas últimas décadas, o que parece estar mais relacionado à explosão populacional de seus respectivos insetos vetores do que ao vírus propriamente dito. De maneira geral, a ação dos vírus apresenta como sintomas característicos o amarelecimento total da planta, nanismo acentuado e severo enrugamento das folhas terminais das plantas, podendo ocasionar perdas totais na produção [5]. Considerando-se o alto grau de severidade de doenças causado por esses vírus, a relativa inexistência de fontes naturais de resistência no Brasil, a ampla gama de hospedeiros (plantas daninhas, silvestres e ornamentais) e a pouca informação referente às espécies encontradas no país, essa é, atualmente, a principal doença que afeta os tomateiros nas regiões produtoras para processamento industrial [1]. O RAPD (“Random Amplified Polymorphic DNA”) é uma técnica derivada da PCR que utiliza primers mais curtos e de seqüência arbitrária na reação de amplificação, eliminando a necessidade do conhecimento prévio da seqüência. É uma técnica muito utilizada para a identificação de marcadores moleculares ligados à resistência a bactérias, fungos, vírus, entre outras aplicações. Este trabalho teve como objetivo distinguir, fazendo uso do RAPD, cultivares resistentes de cultivares suscetíveis a geminiviroses, gerando um padrão de bandas específico para cada grupo.
2. MATERIAL E MÉTODOS
DNA proveniente de folhas jovens de plantas de tomate da linhagem LA3473, resistente a geminivírus, e da cultivar Viradoro, suscetível a geminivírus, foi submetido à análise por RAPD na tentativa de encontrar marcadores para a identificação de resistência ou suscetibilidade. Foram empregados 20 primers da série OPP (Operon Technologies Inc.) para a amplificação do material, cuja mistura básica continha: 10 ng de DNA/ml, 2.5 l do tampão de PCR (Amersham Pharmacia) (10X); 1.7 l de MgCl2 (25 mM); 1.25 l da solução de dNTPs (2mM cada); 2.5 l do primer (4µM) e 0.4 l de Taq polimerase (5 U/ml); água q.s.p. 25 l. O material foi submetido às seguintes etapas de amplificação: um ciclo de desnaturação a 94oC  por 3 min. seguido por 94oC por 15 seg., 42oC por 30 seg. e 72oC por 1 minuto. As três últimas etapas foram repetidas quarenta e três vezes. A amplificação foi concluída a 72oC por 7 minutos. Os amplicons foram separados em gel de poliacrilamida 6%. 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos 20 primers constantes do kit OPP empregado, apenas oito produziram produtos de amplificação com DNA de tomateiro. Ao se comparar os padrões de bandas obtidos pela separação em eletroforese em SDS poliacrilamida dos produtos de amplificação gerados no RAPD (Figura 1), seis primers mostraram ser discriminativos, produzindo um padrão de bandas para a cultivar Viradoro muito distinto daquele obtido para a linhagem LA3473. Para todos estes primers não foram obtidas bandas para a linhagem LA3473 quando se empregou 1 l de DNA de tomate previamente diluído 104 vezes em TE. Ao contrário, um padrão composto por pelo menos três bandas nítidas foi obtido para a cultivar Viradoro nestas condições. A redução da quantidade de DNA alvo na reação, pela diluição prévia do DNA extraído das plantas em 5 x 104 vezes, resultou no aparecimento de uma a três bandas de pouca intensidade na amplificação do DNA obtido da linhagem LA3473 para 4 primers, conservando o padrão complexo de bandas para a outra cultivar, para os seis primers selecionados.
Segundo [8] diferentes fontes e concentrações de primers influenciam o padrão de bandas e certos primers produzem padrões de bandas mais confiáveis quando usados em concentrações mais altas do que o usual, provavelmente porque o DNA genômico usado possui uma freqüência muito rara de sítios de anelamento para estes primers de modo que sua concentração efetiva para amplificação é diminuída no tubo da reação. Este efeito também foi observado em um mesmo laboratório utilizando DNA de Musa com os mesmos primers. No presente trabalho efeito semelhante no padrão de bandas foi observado com diferentes concentrações de DNA genômico, onde para a cultivar Viradoro à medida que havia um aumento da concentração de DNA genômico, bandas de maior peso molecular podiam ser visualizadas, com qualquer um dos cinco primers empregados, exceto OPP5. A intensidade do marcador RAPD está associada com o grau de homologia entre o primer e a amostra ou com a amplificação de outros fragmentos na amostra [2], o que pode explicar o aparecimento de bandas de menor intensidade no presente trabalho. 
4. CONCLUSÂO
Pode-se inferir que a metodologia utilizada mostrou-se satisfatória para a discriminação de plantas de tomate resistentes e suscetíveis a geminivírus, visto que um padrão de bandas reproduzível foi obtido para o material suscetível.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1Bezerra, I.C.; Lima, M.F.; Nunes, M.U.C.; Lopes, E.S.; Ávila, A.C.  New record of geminivirus occuring in Northeast region of Brazil. Programa e Resumos, 9º Encontro Nacional de Virologia, 1998, São Lourenço, MG, p.143.
2Divaret, I.; Margalé, E.; Thomas, G. RAPD markers on seed bulks efficiently assess the genetic diversity of a Brassica oleracea L. collection. Theoretical and Applied Genetics, 1999, v.98, p.1029-1035.
3Faria, J.C.; Bezerra, I.C.; Zerbini, F.M.; Ribeiro, S.G.; Lima, M.F.  Situação atual das geminiviroses no Brasil. Fitopatologia brasileira, 2000, v.25, p.125-137. 
4Filgueira, F.A.R. Novo Manual de Olericultura: agrotecnologia moderna na produção e comercialização de hortaliças. Viçosa: UFV, 2000, 402p., il.
5Haji, F.N.P.; Alencar, J.A.; Lima, M.F.; Mattos, M.A.A.; Honda, O.T.; Haji, A.T. Avaliação de produtos para o controle da mosca branca (Bemisia spp.) na cultura do tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) Boletim Técnico EMBRAPA, 1997, n.84. 
6IBGE.http://www.ibge.net/home/estatistica/economia/pam/tabela1pam.shtm.07/2000.
7Resende, R.O.; Cupertino, F.P. Doenças causadas por vírus em tomateiro. Informe Agropecuário, Belo Horizonte, 1996, v.18, p.19-27.
8Virk, P.S.; Ford-Lloyd, B.V.; Jackson, M.T.; Newbury, H.J. Use of RAPD for the study of diversity within plant germplasm collections. Heredity, 1995, v.74, p.170-179.

Figura 1: Padrões de bandas de RAPD produzidos pelos primers OPP02, OPP03,OPP04, OPP05, OPP06 e OPP19. LA: linhagem LA 3473, resistente a geminivírus, VIRA: cultivar Viradoro, suscetível ao geminivírus, 1:10 e 1:50: diluições do DNA.