MEIO NUTRITIVO, REGULADOR DE CRESCIMENTO E FRIO NO ESTABELECIMENTO IN VITRO DE MIRTILO, CV. DELITE1

Silva, L. C.2*, Schuch, M. W.3, Souza, J. A.4, Antunes, L. E. C.5 

1Laboratório de Micropropagação de Plantas Frutíferas; Apoio MCT-CNPq, FAPERGS.
2* Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado, FAEM/UFPel. E-mail: lucianecouto@yahoo.com.br Bolsista CAPES.
3 Engenheira Agrônoma, Dra., Professora do Departamento de fitotecnia, FAEM/UFPel. Caixa Postal 354, 96010-900, Pelotas, RS. E-mail: marciaws@ufpel.tche.br
4 Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado, FAEM/UFPel. Pelotas, RS. E-mail: joseas@ufpel.tche.br Bolsista CNPQ.
5 Engenheiro Agrônomo, Dr., Pesquisador da Embrapa Clima Temperado. Caixa Postal 403,
 BR 392 Km 78 Pelotas, RS.

INTRODUÇÃO

O mirtilo é uma espécie frutífera de clima temperado que apresenta grande importância comercial em países da Europa e nos Estados Unidos [5]. No Brasil, as áreas de cultivo de mirtilo ainda são incipientes, sendo as dificuldades técnicas de propagação os principais fatores que restringem a viabilização e expansão desta espécie [3]. 
	O cultivo in vitro é uma alternativa para aumentar a disponibilidade de plantas em curto prazo. Esta tecnologia permite obter uma grande quantidade de plantas a partir de quantidades mínimas de material vegetal, permitindo assim aumentar a oferta de mudas, contribuindo para o desenvolvimento produtivo desta nova oportunidade de crescimento e diversificação ao nível do setor horti-frutícola [2].
	Os meios nutritivos utilizados para a cultura de células, tecidos e órgãos de plantas fornecem as substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão de desenvolvimento in vitro [1]. Diversas formulações de meios básicos tem sido utilizadas no inicio do cultivo [6].
Outro fator determinante no crescimento e no padrão de desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultura de tecidos é a composição e a concentração de hormônios no meio de cultivo [1]. As citocininas são reguladores de crescimento que desempenham um papel fundamental no crescimento e morfogênese em cultura de tecidos, estimulando a divisão celular, bem como, a indução e a proliferação de brotações adventícias [4].
Sendo uma espécie de clima temperado, o mirtilo necessita de frio para a quebra da dormência e uma boa brotação de gemas, podendo este fator ser benéfico também na brotação dos segmentos nodais colocados in vitro, permitindo uma maior percentagem de estabelecimento.
Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do tipo de meio de cultivo, do tipo de regulador de crescimento e do frio no estabelecimento in vitro de mirtilo cv Delite.

MATERIAL E MÉTODOS 

O trabalho foi realizado no Laboratório de Micropropagação de Plantas Frutíferas, Departamento de Fitotecnia, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, da Universidade Federal de Pelotas, RS. O material vegetal constituiu-se de mudas de mirtilo, cultivar Delite, fornecidas pela Embrapa-Clima Temperado.
Os tratamentos constituíram-se de dois tipos de meio de cultivo (WPM e MS), de dois tipos de reguladores de crescimento (2-iP e zeatina) e dois tipos de manutenção dos ramos doadores de explantes (coletados diretamente da casa de vegetação e colocados na geladeira, durante 15 dias), totalizando 8 tratamentos. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com quatro repetições por tratamento. Cada repetição constituiu-se de cinco tubos de ensaio com um explante.
	O explante constituiu-se de segmento nodal extraído do material coletado da casa de vegetação e do material que estava na geladeira.
	Na coleta do material, os ramos foram cortados com comprimento de aproximadamente 30cm e levados no escuro até laboratório. No dia da instalação do experimento os ramos permaneceram por cerca de 2 minutos em água corrente, após foi feito toalete, segmentando-os e eliminando-se as folhas na altura do pecíolo, sendo em seguida os segmentos desinfestados em câmara de fluxo laminar onde o material foi colocado em álcool 70% por 10 segundos, seguindo pela imersão em uma solução de hipoclorito de sódio (concentração de 2,5%), adicionada 2 gotas de Tween 20, pelo período de 10 minutos e após lavadas por três vezes em água destilada e autoclavada. 
	Os meios de cultura utilizados foram o MS [9] e o WPM [7], metade acrescido de 25M de 2-iP e outra metade acrescida de 18M de zeatina, sendo o pH ajustado para 5,5 antes da inclusão do ágar na concentração de 6gL-1 e, posteriormente, autoclavado a 121ºC e 1,5atm por 20 minutos. Foram utilizados tubos de ensaio com 10mL de meio de cultura. 
	Após a inoculação, os explantes permaneceram no escuro, a 25  2ºC, por um período de 7 dias, visando diminuir a oxidação fenólica. Em seguida foram transferidos para sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas luz, temperatura de 25  2ºC e densidade de fluxo de fótons do período de luz de 27molm-2s-1.
	Aos 7, 14 e 21 dias de cultivo avaliou-se a porcentagem de contaminação fúngica e bacteriana além da percentagem de explantes oxidados e percentagem de brotação dos explantes. Aos 30 e 45 dias de cultivo além das variáveis analisadas anteriormente foi avaliado a sobrevivência e o estabelecimento dos explantes. A sobrevivência foi indicada pela coloração verde do explante e o estabelecimento foi determinado pelo desenvolvimento dos primórdios foliares no explante. 
	Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos comparadas estatisticamente pelo teste de Duncan, através do uso do programa estatístico SANEST [11]. Os dados em porcentagem foram transformados em arco seno da raiz quadrada de x/100, onde x é o percentual obtido.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
	Para as variáveis percentagem de contaminação fúngica e contaminação bacteriana a analise da variância permitiu verificar que os fatores não apresentaram efeito significativo.
	Para a variável percentagem de oxidação a analise da variância permitiu verificar que houve interação entre tipo de regulador de crescimento e tipo de manutenção dos ramos doadores de explantes, sendo que os explantes retirados de ramos mantidos na casa de vegetação apresentaram maior oxidação quando foi utilizado o 2-iP como regulador de crescimento.
	Para percentagem de sobrevivência o regulador de crescimento mostrou efeito significativo, o desdobramento das médias pelo teste de Duncan mostrou que os explantes em meio de cultivo com zeatina apresentaram maior sobrevivência que os explantes em meio de cultivo com 2-iP, 58,00% e 40,74%, respectivamente.
Segundo Salomão et al [10], o desenvolvimento de parte aérea em explantes de caquizeiro foi maior quando utilizaram zeatina na concentração de 10M isoladamente ou em combinação com AIA, resultados este semelhante aos obtidos no presente trabalho.
	Para percentagem de estabelecimento a analise da variação permitiu verificar que houve interação entre meio de cultivo e tipo de regulador de crescimento e entre regulador de crescimento e tipo de manutenção dos ramos doadores de explantes, sendo que o meio de cultivo WPM apresentou maior estabelecimento (Tabela 1). 
Resultados semelhantes foram obtidos por Mello et al [8], quando testaram diferentes meios nutritivos (MS, DKW e WPM) no estabelecimento in vitro de acerola, observaram que os melhores resultados foram obtidos por explantes originados de casa de vegetação inoculados em meio WPM. 
	Quando os explantes foram mantidos em casa de vegetação os explantes em meio de cultivo com zeatina apresentaram maior estabelecimento, 21,63% contra 1,62% em meio suplementado com 2-iP.

Tabela 1: Percentagem de estabelecimento em explantes de mirtilo cv. Delite obtidas após 45 dias de cultivo in vitro  
	Percentagem de estabelecimento	
Citocininas
	Meio de cultivo	
	WPM	MS	
2-iP	17,52 a	3,36   b	
Zeatina	60,24 a	1,69   b	
Letras distintas dentro de cada linha diferem entre si pelo teste de Duncan a 5%
A adição de citocininas no meio de cultivo na fase de estabelecimento in vitro, segundo Gratapaglia & Machado [6], é indispensável para auxiliar a superação da dominância apical e indução de gemas axilares. 

CONCLUSÕES

	A zeatina proporcionou maior sobrevivência e estabelecimento dos explantes in vitro, além de diminuir a oxidação dos mesmos.
	O meio de cultivo WPM proporcionou melhor resultado no estabelecimento in vitro de mirtilo cv Delite.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1]CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios nutritivos. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. BrasÌlia: Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, 1998, p. 87-132.

[2] CASTILLO, A.; CARRAU, F.; LEONI, C.; PEREIRA, G. Investigación en arandanos en Uruguay: propagación in vitro Y evaluación de variedades por INIA. In: 2º SIMPÓSIO NACIONAL DO MORANGO E 1º ENCONTRO DE PEQUENAS FRUTAS E FRUTAS NATIVAS DO MERCOSUL, 2004, Pelotas: Embrapa Clima Temperado. Anais do 2º Simpósio Nacional do Morango e 1º Encontro de Pequenas Frutas e Frutas Nativas do Mercosul. Pelotas: Embrapa Clima Temperado, 2004, p. 225-228.

[3] EMBRAPA. Centro Nacional de Pesquisa de Fruteiras de Clima Temperado (Pelotas – RS). Relatório Técnico – 1980 a 1990. Pelotas. Embrapa – CNPFT, 1991. 125p.

[4] FLORES, R.; STEFANELLO, S.; FRANCO, E. T. H.; MANTOVANI, N. Regeneração in vitro de espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart.). Revista Brasileira de Agrociência, v. 4, n. 3, p. 201-205, 1998.

[5] FRANÇA, S. Mirtilo: uma doce e rendosa novidade. Manchete Rural, Rio de Janeiro, n. 46, p. 32-34, 1991.

[6] GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, 1998, p. 183-260.

[7] LLOYD, G.; MCCOWN, B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, kalmia latifolia, by use os shoot-tip culture. Combined Proceedings International Plant Propagators Society, v. 30, p. 421- 427, 1980.

[8] MELLO, N.F.; OKASAKI, W. Y.; LEITE, C. B.; FÁRI, M. Estabelecimento do cultivo in vitro da aceroleira (malpighia emarginata dc.). Ciência e Agrotécnica, Lavras, v. 23, n. 1, p. 102-107, 1999.

[9] MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossay with tabacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Kobenhavn, v. 15, p. 473-497, 1962.

[10] SALOMÃO, L. C. C.; VIECCELLI, J. C.; SIQUEIRA, D. L.; OTONI, W. C. Micropropagação de caquizeiro ‘cereja’ por meio de gemas apicais e laterais de plantas juvenis e adultas. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 22, n. 1, p. 66-71, 2000. 

[11] ZONTA, E. P.; MACHADO, A. A. SANEST – Sistema de análise estatística para microcomputadores. Pelotas: DMEC/IFM/UFPel, 1987. 138p.