EFEITO DA ILUMINAÇÃO E DA PRÉ-LAVAGEM DOS RAMOS NO ESTABELECIMENTO IN VITRO DE MIRTILO, CV. FLORIDA1 

Silva, L. C.2*;  Schuch, M. W.3; Souza, J. A.4; Antunes, L. E .C.5

1 Laboratório de Micropropagação de Plantas Frutíferas. Apoio MCT-CNPq, FAPERGS
2 Engenheira Agrônoma, Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado, FAEM/UFPel. Pelotas, RS. E-mail: lucianecouto@yahoo.com.br Bolsista CAPES.
3 Engenheira Agrônoma, Dra., Professora do Departamento de fitotecnia, FAEM/UFPel. Caixa Postal 354, 96010-900, Pelotas, RS. E-mail: marciaws@ufpel.tche.br
4 Engenheira Agrônoma, M. Sc., Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado, FAEM/UFPel. Pelotas, RS. E-mail: joseas@ufpel.tche.br Bolsista CNPQ.
5 Engenheiro Agrônomo, Dr., Pesquisador da Embrapa Clima Temperado. Caixa Postal 403,
BR 392 Km 78 Pelotas, RS 

INTRODUÇÃO
	
	O cultivo de pequenas frutas no Brasil tem despertado a atenção de produtores, comerciantes e consumidores especialmente nos últimos anos. Este fato é resultante da difusão da informação sobre as características e propriedades das espécies, como a exigência de muita mão-de-obra, trabalhos muito intensos, mas com a real possibilidade da obtenção de alto retorno econômico, em áreas de pequeno cultivo e num curto espaço de tempo[5].O mirtilo (Vaccinium spp), está classificado entre as pequenas frutas como espécie que apresenta grande potencialidade econômica além de importantes características nutracêuticas, tais como elevados teores de substâncias antioxidantes e anticancerígenas. Considerando tratar-se de espécies em sua maioria novas e ainda com cultivo esparso no Brasil, os desafios tecnológicos de produção, somados aos entraves de mercado, demonstram que há muitos desafios a serem vencidos, porém as potencialidades da produção e da rentabilidade destas culturas são altamente promissoras.
	A cultura de tecidos é uma técnica que proporciona com sucesso o estabelecimento de protocolos de micropropagação massal de frutíferas, e que já vem sendo utilizada com eficientes resultados para a produção de mudas de mirtilo no Uruguai [1].
	O cultivo in vitro é um método viável para propagação de diversas espécies frutíferas, no entanto a maior dificuldade está em obterem-se tecidos descontaminados que possibilitem o desenvolvimento do explante. Dentre as substâncias germicidas mais utilizadas na desinfestação dos explantes, destacamos o etanol e os compostos a base de cloro, tais como hipoclorito de sódio e de cálcio [2]. Outra grande dificuldade está na oxidação dos tecidos, gerada pela liberação de compostos fenólicos originados pelo corte que danificam as células dos tecidos, onde tal processo se acelera na presença de luz. 
	Este trabalho teve como objetivo, avaliar o efeito da ausência de luz e os diferentes métodos de pré - lavagem para o estabelecimento in vitro de mirtilo.   

MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado no Laboratório de Micropropagação de Plantas Frutíferas, Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, da Universidade Federal de Pelotas, RS. O material vegetal utilizado foram mudas de mirtilo, cultivar Florida, cedidas pela Embrapa-Clima Temperado.
Os tratamentos constituíram-se de duas maneiras de manter as plantas matrizes na casa de vegetação (com luz natural e 15 dias no escuro), de três tipos de pré-lavagem dos explantes (água normal da torneira, água autoclavada e destilada e sem lavar), totalizando 6 tratamentos. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente  casualizado, com quatro repetições por tratamento. Cada repetição constituiu-se de cinco tubos de ensaio com um  explante.
	O explante constituiu-se de segmento nodal extraído de material cultivado em casa de vegetação. Visando diminuir a contaminação in vitro, as mudas mantidas em casa de vegetação, foram pulverizadas semanalmente, por duas semanas consecutivas, com antibiótico Agrimicina (Estreptomicina) e fungicida Benlat (Benomil) nas doses de 2,4gL-1 e 0,6gL-1, respectivamente.
	Na coleta do material, os ramos foram cortados com comprimento de aproximadamente 30cm e levados no escuro até o laboratório, onde permaneceram por cerca de 3 minutos em contato com água da torneira ou água destilada e autoclavada, sendo esta, trocada três vezes. Após foi feito toalete nos ramos, eliminando-se as folhas na altura do pecíolo e segmentando-os, sendo em seguida desinfestados os segmentos em câmara de fluxo laminar onde o material foi colocado em álcool 70% por 10 segundos, seguindo pela imersão em uma solução de hipoclorito de sódio (concentração de 2,5%), adicionada 2 gotas de Tween 20, pelo período de 10 minutos e após lavadas por três vezes em água destilada e autoclavada. 
	O meio de cultura utilizado foi o MS [3] acrescido de 25M de 2-iP, sendo o pH ajustado para 5,5 antes da inclusão do ágar na concentração de 6gL-1 e, posteriormente, autoclavado a 121ºC e 1,5atm por 20 minutos. Foram utilizados tubos de ensaio com 10 mL de meio de cultura. 
	Após a inoculação, os explantes permaneceram no escuro, a 25  2ºC, por um período de 7 dias, visando diminuir a oxidação fenólica. Em seguida foram transferidos para sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas luz, temperatura de 25  2ºC e densidade de fluxo de fótons do período de luz de 27molm-2s-1.
	Aos 7, 14 e 21 dias de cultivo avaliou-se a porcentagem de contaminação fúngica e bacteriana além da porcentagem de explantes oxidados. Aos 30 e 45 dias de cultivo além das variáveis analisadas anteriormente foi avaliado a sobrevivência e o estabelecimento dos explantes. A sobrevivência foi indicada pela coloração verde do explante e o estabelecimento foi determinado pelo desenvolvimento dos primórdios foliares no explante. 
	Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos comparadas estatisticamente pelo teste de Duncan, através do uso do programa estatístico SANEST [7]. Os dados em porcentagem foram transformados em arco seno da raiz quadrada de x/100, onde x é o percentual obtido.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para a variável percentagem de contaminação fúngica, o teste de Duncan permitiu verificar que os explantes que não sofreram lavagem contaminaram menos quando foram retirados de plantas matrizes em condições normais de iluminação. Resultados semelhantes foram encontrados pelos autores Sato et al. [4] que no estabelecimento in vitro de Celtis sp. observaram uma menor contaminação fúngica nos tratamentos que não utilizaram a lavagem dos ramos,os referidos autores atribuíram estes resultados ao fato dos fungos estarem impregnados nos tecidos e com a lavagem estes teriam facilmente se espalhados com a ajuda da água. 
Para a variável porcentagem de contaminação bacteriana, oxidação dos explantes e percentagem de sobrevivência dos explantes, os fatores estudados não apresentaram efeito significativo pela análise da variância. 
Para a variável porcentagem de estabelecimento dos explantes verificou-se, aos 30 dias de cultivo in vitro, que o tipo de manutenção das plantas matrizes na casa de vegetação foi altamente significativo ( = 0,01). Os explantes retirados das plantas que permaneceram por 15 dias no escuro apresentaram maior percentagem de estabelecimento (Tabela 1). Estes resultados estão de acordo com os encontrados em trabalho semelhante realizado por Silveira et al. [6], onde observaram uma maior percentagem de sobrevivência, brotação e enraizamento em estacas de abacateiro submetidas ao estiolamento.

Tabela 1 – Porcentagem de explantes de mirtilo cultivar Florida estabelecidos, após 30 dias de cultivo in vitro 
Manutenção das plantas matrizes	Percentagem de Explante Estabelecido	
Escuro 	6,13 a	
Condições normais de iluminação	  0,00   b	
Letra distintas na coluna diferem entre si pelo teste de Duncan a 5%.

CONCLUSÕES

Planta-matriz submetida ao escuro favorece o estabelecimento in vitro de explantes de mirtilo.
Planta-matriz submetida ao escuro favorece a contaminação fúngica dos explantes quando estes não são pré-lavados.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 [1] CASTILLO, A.; CARRAU, F.; LEONI, C.; PEREIRA, G. Investigación en arandanos en Uruguay: propagación in vitro Y evaluación de variedades por INIA. In: 2º SIMPÓSIO NACIONAL DO MORANGO E 1º ENCONTRO DE PEQUENAS FRUTAS E FRUTAS NATIVAS DO MERCOSUL, 2004, Pelotas: Embrapa Clima Temperado. Anais do 2º Simpósio Nacional do Morango e 1º Encontro de Pequenas Frutas e Frutas Nativas do Mercosul. Pelotas: Embrapa Clima Temperado, 2004. p. 225-228.

[2] GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, 1998. p. 183-260.

[3] MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossay with tabacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Kobenhavn, v. 15, p.473-497, 1962

[4] SATO, A. Y. DIAS, H. C. T.; ANDRADE, L. A.; SOUZA, V. C. Micropropagação de Celtis sp: controle da cantaminação e oxidação. Cerne, v. 7, n. 2, 2001. p. 117 - 123.

[5]TEIXEIRA, J. B. Disponível em:
 <http://www.redbio.org/portal/encuentros/enc_2001/simposios>. Acesso .em 25 julh. 2004.

[6] SILVEIRA, S. V. SOUZA, P. V. D.; KOLLER, O. C. Propagação vegetativa de abacateiro por estaquia. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 26, n. 1, 2004. p. 191-192
.
[7] ZONTA, E. P.; MACHADO, A. A. SANEST – Sistema de análise estatística para microcomputadores. Pelotas: DMEC/IFM/UFPel, 1987. 138p.