CARACTERIZAÇÃO ISOENZIMÁTICA DE ESPÉCIES DE CAMOMILA

Souza, J. A.1*; Bobrowski, V. L.2; Rocha, B. H. G.2

1* Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima Temperado, FAEM/UFPel. E-mail: joseas@ufpel.tche.br Bolsista CNPQ.
2 Professoras  do Departamento de Zoologia e Genética, IB/UFPel. Caixa Postal 354, 96010-900, Pelotas, RS. 

INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais é uma prática generalizada na medicina popular. Dentre os múltiplos recursos terapêuticos da medicina popular destacam-se as plantas cujo uso, aplicação e nomenclatura variam de uma região para outra e de informante para informante, às vezes, da mesma área de pesquisa [3; 14]. 
 A camomila pertencente à família Asteraceae, sendo o mais popular medicamento de ervas conhecido, usado no tratamento de várias doenças, tanto interna como externamente. Seu emprego é tão difuso, que não é exagero afirmar, que não existe país no mundo inteiro onde a camomila não é considerada um dos remédios caseiros mais eficazes [6; 17].
	As isoenzimas, geralmente fornecem ampla informação genética para diversas aplicações, além de serem tecnicamente acessíveis e de baixo custo. Tecidos vegetais como: semente, raiz, folha, pólen, entre outros, em diferentes fases de desenvolvimento, podem ser escolhidos para análise eletroforética. Além disso, elas são, de modo geral, excelentes marcadores moleculares. O controle genético do polimorfismo enzimático parece ser amplamente monogênico, sendo que, geralmente os genes que as codificam possuem interação alélica do tipo codominante [1; 10; 12].   
	A eletroforese é um método simples, que apresenta resultados em pouco tempo. Requer um mínimo de conhecimento de química e equipamentos não muito dispendiosos, além disso, permite usar extratos de tecidos crus, evitando as dificuldades técnicas e distorções moleculares que, às vezes, ocorrem nos estudos em que são necessárias enzimas purificadas. 
	 A descoberta das múltiplas formas moleculares das enzimas propiciou amplas perspectivas para sua utilização na identificação de genótipos, na detecção de diferenças intra e interespecíficas, na avaliação de germoplasmas, assim como na relação indireta de caracteres agronômicos, entre outras. 
	Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi o de caracterizar isoenzimaticamente três espécies de camomila: a camomila comum ou alemã (Matricaria chamomilla L.), a camomila húngara (Matricaria recutita L.) e a camomila romana ou camomila dos ingleses (Anthemis nobilis L.).

MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Eletroforese da Embrapa Clima Temperado, Pelotas/RS.  
Foram analisadas folhas de plantas de camomila romana (Anthemis nobilis L.), oriundas da cultura de tecidos, e folhas de plântulas de camomila alemã e húngara (Matricaria chamomilla L. e Matricaria recutita L., respectivamente), provenientes da germinação de sementes in vitro, ambas cultivadas em meio MS [9] sem hormônios. As amostras homogeneizadas em conjunto consistiram de 20 indivíduos, com três repetições para cada espécie. Os extratos foram obtidos pela maceração das amostras em tampão usado no gel, na proporção de 1:1, acrescido de 0,15% de 2-mercaptoetanol, em placas de porcelana mantidas sobre gelo, com auxílio de bastão de vidro esmerilhado. Papel filtro (Whatmann 3MM), de 1,5 x 4mm, foi embebido na amostra e aplicado no gel, em superfícies feitas com auxílio de um pente de aço inoxidável.
 Nas análises de peroxidase (PRX), leucina aminopeptidase (LAP), fosfatase ácida (FAC), esterase (EST) e aspartato transaminase (AT), foram empregados o sistema de tampões descrito por Scandalios [12] e géis de poliacrilamida na concentração de 6%. Para os sistemas enzimáticos da isocitrato desidrogenase (IDH) e 6-fosfogluconato desidrogenase (6-PGD) foram utilizados o sistema de tampões descrito por Shields et al. [13] e géis de poliacrilamida a 5%.
As migrações eletroforéticas foram efetuadas em câmara fria com temperatura entre 4 e 6ºC. A diferença de potencial foi mantida ao redor de 10 volts.cm-1, até que o fronte, marcado pelo azul de bromofenol, atingisse 9 cm do ponto de aplicação. 
Na revelação dos géis, foram usados os sistemas de coloração descritos por Vallejos [16], para isocitrato desidrogenase e 6-fosfogluconato desidrogenase, Ayala et al. [2] para aspartato transaminase (AT) e por Scandalios [12], para os demais.
As mobilidades relativas foram calculadas dividindo-se a medida de todas as bandas por uma, tomada como referência, da espécie Matricaria chamomilla L.
Para a estimativa da similaridade entre as espécies, foi usado o coeficiente de Jaccard, através do SIMQUAL (similaridade para dados qualitativos), e para a análise de agrupamento o UPGMA (método da média aritmética não ponderada), através do SHAN (agrupamento seqüencial, aglomerativo, hierárquico e exclusivo), conforme Sneath & Sokal, citados por Crisci & Armengol [4], empregando-se o NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis for Personal Computers), v 1.7 [11]. O dendrograma foi seccionado ao nível de precisão de 0,70 para observação dos grupos formados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Algumas bandas isoenzimáticas foram excluídas da análise, pois segundo a ISTA (Internacional Seed Testing Association, 1992), somente as bandas nítidas e com repetibilidade devem ser usadas para a diferenciação de materiais. Além disso, para evitar diferenças na atividade isoenzimática, associada a diferentes estádios de crescimento, e influência de condições ambientais foram usadas plantas cultivadas in vitro, pois estes fatores podem ser limitantes ao uso das isoenzimas como marcadores moleculares [5]. Além disso, Freitas et al. [7], em seus testes preliminares com capim-elefante e seus híbridos com milheto, observaram um considerável número de bandas em tecido de meristema apical aéreo e ponta de raiz, mas o maior número de bandas foi obtido em tecido de folhas jovens. 
	Foram observados três padrões eletroforéticos de esterase-EST, de leucina aminopeptidase-LAP, de fosfatase ácida-FAC, de isocitrato desidrogenase-IDH e de 6-fosfogluconato desidrogenase-6-PGDH, que apresentaram de três a cinco, uma a duas, duas a cinco, duas a três e uma a duas bandas, respectivamente, e dois padrões eletroforéticos de aspartato transaminase-AT e peroxidase-PRX, com três a cinco e duas a três bandas, respectivamente. Com estes sistemas, foram consideradas 39 bandas, sendo que AT e PRX possibilitaram a diferenciação somente entre os gêneros e não entre as espécies de Matricaria.
	A técnica de eletroforese de isoenzimas foi utilizada, por Steenbock [15], para análise da diversidade genética e taxa de cruzamento de espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss) em populações naturais. Estes autores utilizaram treze sistemas enzimáticos, dentre os quais encontram-se os sete sistemas usados neste trabalho. 
Messeguer et al. [8], usando quatorze sistemas enzimáticos em pólen de pessegueiro, analisaram 81 cultivares, sendo que treze (17%) apresentaram um único fenótipo isoenzimático. Os resultados, obtidos por estes autores, sugerem que as isoenzimas podem ser usadas como um complemento vantajoso de outras características, mas que o uso exclusivo destas não é suficiente, principalmente para distinção entre genótipos que apresentam uma estreita base genética.	 
Os coeficientes de similaridade, calculados com base na presença ou ausência de bandas isoenzimáticas de folhas de plantas de camomila, foram de 0,11, observado nas comparações entre Anthemis nobilis e Matricaria recutita, de 0,14 entre Anthemis nobilis e Matricaria chamomilla e de 0,68 entre as duas espécies de Matricaria (Tabela 1). Conforme o esperado, a similaridade genética entre as duas espécies do mesmo gênero foi maior que a encontrada entre os gêneros diferentes.
A análise de agrupamento, pelo método UPGMA, possibilitou a classificação das espécies em três grupos, ao nível de precisão de 0,70 (Figura 1).

Tabela 1: Similaridade genética, estimada pelo coeficiente de Jaccard, entre três espécies de camomila, com base na análise de isoenzimas de folhas de plantas cultivadas in vitro
Espécies	A. nobilis 	M. chamomilla	M. recutita	
A. nobilis 	1,00			
M. chamomilla 	0,14	1,00		
M. recutita 	0,11	0,68	1,00	

Anthemis Nobilis L.

Matricaria chamomilla L.

Matricaria recutita L.

Figura 1: Dendrograma de três espécies de camomila, pelo método UPGMA, baseado na análise de isoenzimas de folhas de plantas cultivadas in vitro. 

CONCLUSÕES
O polimorfismo isoenzimático de esterase (EST), leucina aminopeptidase (LAP), fosfatase ácida (FAC), isocitrato desidrogenase (IDH) e 6-fosfogluconato desidrogenase (6-PGDH), evidencia a variabilidade genética entre gêneros e espécies, enquanto que os padrões eletroforéticos de aspartato transaminase (AT) e peroxidase (PRX) somente a variabilidade entre os gêneros.  
A análise de agrupamento pelo método UPGMA, permite a classificação das espécies em grupos.  
Conclui-se, portanto, que é possível caracterizar e diferenciar espécies de camomila através de análise de isoenzimas.  

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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[3]CAMARGO, M. T. L. Medicina popular. São Paulo, 1985. 180p.
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[5]FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores em análise genética. Brasília : Embrapa-Cenargen, 1998, 220p. 
[6]FRANCO, L. L. As sensacionais 50 plantas medicinais campeãs de poder curativo. Curitiba, 1999. 235p.
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[17]YARZA, O. Plantas que curam & plantas que matam. São Paulo, 1982, 232p.