CLOROSE EM GENÓTIPOS MUTANTES DE ARROZ SUBMETIDOS A ESTRESSE POR FRIO NO PERÍODO VEGETATIVO

Silveira, G.1*; Martins, A.F.1; Oliveira, A.C.1; Cruz, R.P.2; Carvalho, F.I.F.1; Kopp, M.M.1; Luz, V.K.1; Carvalho, M.F.1; Vieira, E.A.1; Magalhães, T.R.1; Silva, V.N.1 

1Centro de Genômica e Fitomelhoramento – DFT – FAEM/UFPEL
Campus Universitário – Caixa Postal 354 – CEP 96010-900
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1.	INTRODUÇÃO

A tolerância ao frio é uma característica extremamente desejável em genótipos de arroz cultivados no sul do Brasil, onde as temperaturas baixas diminuem o rendimento de grãos. A tolerância ao frio é uma das características de difícil seleção a campo, pois a época e duração do estresse são imprevisíveis, limitando o progresso ao nível de melhoramento [2].
A faixa ótima para a cultura se encontra entre 25º C e 30º C e, temperaturas inferiores a 20º C dependendo do período de desenvolvimento são prejudiciais, sendo muito comuns em áreas temperadas e subtropicais ou nas regiões de altitude elevada nos trópicos [7], limitando as áreas de produção e o período de cultivo.Vários procedimentos de avaliação estão sendo utilizados para selecionar genótipos tolerantes ao frio em períodos específicos de desenvolvimento da planta [3].
	A tolerância ao frio em diferentes estádios de desenvolvimento da planta é controlada por genes que atuam independentemente nos períodos de germinação, vegetativo e reprodutivo [1]. Um genótipo de arroz pode ser tolerante ao frio no período vegetativo e sensível no reprodutivo ou vice-versa, devido aos vários genes de tolerância e os diversos mecanismos fisiológicos envolvidos na tolerância ao frio em cada período [5].
	A identificação de genótipos tolerantes ao caráter para utilização em programas de melhoramento requer variabilidade genética. O DNA de um organismo não é uma molécula estática, pois suas bases estão expostas a agentes, naturais ou artificiais, que podem modificar sua estrutura ou composição [2]. Essas modificações súbitas ocorridas no material genético são denominadas mutações [6]. As mutações podem ocorrer tanto nas células germinativas quanto nas somáticas e se constituem em uma fonte de variabilidade genética, causando alterações no número e estrutura dos cromossomos, assim como nos genes individuais. 
Dentre os mecanismos fisiológicos responsáveis pelos danos de frio, tem-se o impedimento do funcionamento da membrana celular e de organelas [4], a inibição da fotossíntese devida à foto-oxidação da clorofila nos cloroplastos [9] e o estresse oxidativo. Esses danos são causados nos tecidos devido à baixa temperatura e podem ser visualmente percebidos por vários sintomas dependendo do período de desenvolvimento do estresse nas plantas.  
O trabalho teve como objetivo avaliar 329 famílias mutantes de arroz em geração M3 através da avaliação de plantas cloróticas como forma de obtenção de variabilidade genética para o caráter. 

2.	MATERIAL E MÉTODOS

O projeto foi desenvolvido na estação experimental do IRGA localizada no Município de Cachoeirinha-RS. As sementes mutantes pertencem ao Banco de Germoplasma do Centro de Genômica e Fitomelhoramento e encontram-se em geração M3 sendo oriundas da cultivar BRS Taim que sofreu irradiação com 60Co na dose de 250 Gy. As sementes utilizadas foram as famílias possíveis mutantes de arroz e genótipos testemunhas de origem indica (BR-IRGA 420, BRS 7 “TAIM”) suscetíveis e de origem japônica (Diamante) tolerante [2]. 
As 329 famílias de possíveis mutantes foram germinadas juntamente com os genótipos testemunhas em papel plissado á uma temperatura de 28ºC por 3dias. Foram colocadas 20 sementes de cada família de possíveis mutantes, sendo 10 sementes para frio e 10 sementes para tratamento controle. Após a germinação as plântulas se desenvolveram em bandejas celuladas, contendo solo e adubado conforme a recomendação da cultura. Cada bandeja se constituiu de 10 famílias, que foram postas dentro de bacias plásticas para manutenção da lamina d’água necessária ao desenvolvimento das plântulas. As plântulas foram mantidas em casa de vegetação e quando alcançaram três folhas metade das plântulas foram submetidas à temperatura de 10º C por 10 dias em sala climatizada com fotoperíodo de 12 horas e a outra metade permaneceu na casa-de-vegetação com temperatura de 28ºC para controle, segundo metodologia descrita por Cruz [2]. Após 10 dias de frio as plântulas foram submetidas novamente á casa de vegetação, permanecendo por 7 dias, sendo avaliado grau de amarelecimento (clorose) de plantas vivas. Através destes valores foram calculados os percentuais de dano por clorose em cada família e efetuada uma distribuição das famílias de acordo com o nível de dano sofrido.

3. 	RESULTADOS E DISCUSSÃO

Das 329 famílias estudadas, apenas 8 tiveram mais de 50 % de mortalidade devido ao estresse, sendo retiradas da análise pois não puderam ser avaliadas representativamente quanto ao nível de clorose apresentado, resultando um total de 321 famílias analisadas. Provavelmente estas plântulas apresentaram um nível de suscetibilidade muito elevado não sobrevivendo ao estresse.
Os resultados obtidos podem levar a inferir sobre a eficiência na indução de mutação com 60Co em arroz. Das 329 famílias mutantes testadas, apenas 25 tiveram um comportamento similar a cultivar de origem não mutada, apresentando valores de clorose de 20 %. As demais famílias apresentaram, na maioria, valores superiores no nível de clorose (Tabela1), indicando que a mutação pode induzir modificações estruturais em regiões genômicas associadas a tolerância ao frio em arroz. Todavia, a seleção realizada em genótipos sensíveis ao frio pode ter sido realizada objetivando genótipos superiores que indiretamente foram selecionados com certa taxa de tolerância a este caráter. A indução de mutação com objetivo de gerar variabilidade genética para tolerância a fatores bióticos e abióticos como no caso da tolerância ao frio, apresenta baixa eficiência [6]. Assim, os valores encontrados neste estudo, concordam e até superam os obtidos por Maluszynski [6], indicando que apesar da baixa eficiência no número de indivíduos com resposta positiva para o caráter estes resultados ainda são considerados satisfatórios.

Tabela 1. Distribuição do número de famílias em função do nível de clorose avaliado em 321 mutantes M3 de arroz cultivar BRS 7 “TAIM” irradiadas com 60Co.

Clorose (%)	Total de famílias 	Total famílias (%)	
0	17*	5,5	
10	17	5.5	
20	24**	8.2	
30	40	12.2	
40	35	10.9	
50	50	15.2	
60	37	11.6	
70	33	10.3	
80	27	8.5	
90	26	8.2	
100	15	4.9	
* - Cultivar Diamante
** - Cultivares BRS 7 “TAIM” e BR IRGA 420

Das 321 famílias testadas 10,64 % apresentaram valores de clorose abaixo da cultivar testemunha suscetível (BRS 7 “TAIM” e BR IRGA 420), e 5,17 % apresentarem valores nulos de clorose semelhante a cultivar Diamante (tolerante).
A distribuição de freqüências das famílias testadas em função do nível de clorose apresentado (Figura 1) mostrou uma tendência normal, com maior número de famílias apresentando valores de 50 % de clorose. A cultivar tolerante Diamante não apresentou nenhuma planta clorótica, como era esperado, concordando com os resultados obtidos por Cruz [2]. As duas cultivares utilizadas como suscetíveis BRS 7 “TAIM” e BR IRGA 420, apresentaram 20 % de clorose. Esses valores poderiam ser considerados baixos tratando-se de cultivares suscetíveis, porem estas cultivares são recomendadas para estudos como suscetíveis [8]. 

Figura 1. Distribuição de freqüências de plantulas cloroticas em 321 famílias mutantes de arroz cultivar BRS 7 “TAIM” irradiadas com 60Co.

A indução de mutação em arroz tem revelado uma elevada taxa de produção de mutantes albinos. Este tipo de mutação poderia causar erros na análise, porém nenhuma das plântulas cultivadas em ambiente protegido sem estresse por frio apresentou clorose, indicando que a mutação não teve efeito sobre regiões genômicas associadas a produção de clorofila.

4. CONCLUSÕES

Foram identificadas 17 famílias mutantes com potencial para utilização como fonte de variabilidade de tolerância a clorose em plântulas de arroz submetidas ao estresse por frio. A indução de mutação com 60Co é indicada para geração de variabilidade genética para o caráter estudado.

5.	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] BERTIN, P.; BOUHARMONT, J. Use of somaclonal variation and in vitro selection for chilling tolerance improvement in rice. Euphytica, Wageningen, 1997, 96, p. 135-142.
[2] CRUZ, R.P.da. Bases genéticas da tolerância ao frio em arroz (Oryza sativa L.). 2001. 155 p. Tese (Doutorado em Fitotecnia) Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2001.
[3] CRUZ, R.P.da. Caracterização do banco de germoplasma do IRGA quanto à tolerância ao frio em três períodos de desenvolvimento. In: III Congresso brasileiro do arroz irrigado, XXV Reunião da cultura do arroz irrigado. Anais...: Camboriú, 2003. 114-116 p.
[4] LYONS, J.M. Chilling injury in plants. Annual Review of plant physiology, 1973, 24, p. 445-466.
[5] MAHISHI, D.M. et al. Inheritance of panicle exsertion in Oryza sativa under low temperature. In: International rice genetics symposium. Abstracts…: Los Baños,1991. 175-177 p.
[6] MALUSZYNSKI, M. Crop germplasm enhancement througt mutation techiques. In: Proceedings of the international Symposium on Rice Germplasm Evaluation and Enhancement. J. N. Rutger, J. F. Robinson and R. H. Dilday, editors. Arkansas, USA, 1998. 386 p.
[7] NANDA, J.S.; SESHI, D.V. Report of a rice cold tolerance Eorkshop. Los Baños: International Rice Reseach Institute, 1979. Breeding strategy for cold-tolerant rices: 91-99 p.
[8] TAI, T. H. Expansion and molecular characterization of the array of mutations in tropical. I: Molecular Characterization of mutated genes controlling important traits for seed crops. Report of the second FAO/IAEA Research CO-ordination Meeting held in Vienna, Austria, 2000.
[9] TAJIMA, K. Factors and mechanism of chilling injury. In: MATSUO, T. et al. (Eds.) Science of the Rice Plant: Physiology. Tokio: Food and agricultural Policy Research Center, 1995, v. 2, p. 798-812.