Seminário 07/12_ - 2012-12-07
Utilização da glicoproteína D de Herpesvírus bovino tipo 5 expressa em Pichia pastoris como vacina de subunidade
Luana Alves Dummer
Prof. Orientador: Dr. Fábio Pereira Leivas Leite
A meningoencefalite causada pelo Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é responsável por perdas econômicas de pecuaristas na América do Sul. A glicoproteína D (gD) é uma das glicoproteínas que mediam a infecção e é o maior alvo para a produção de anticorpos neutralizantes, o quais podem reduzir a replicação viral. A gD do BoHV-5 possui aproximadamente 417 amino ácidos, sítios de N e O-glicosilação e seis resíduos de cisteínas conservadas, sugerindo pontes dissulfídicas. A clonagem da gD de BoHV-5 foi realizada em Pichia pastoris cepa KM71H MutS através do vetor pPICZαB. Após caracterização da rgD, foram realizados experimentos visando a otimização da expressão desta proteína recombinante em bioreatores e avaliação da imunogenicidade da rgD em camundongos e bovinos. A expressão da rgD em bioreatores foi realizada em meios Fermentation Medium (FM) ou BMMY, induzidos com 1% de metanol com taxa de oxigênio dissolvido mantida estável a 30% durante o período de indução. Para a imunização de camundongos, 25 fêmeas entre 6-9 semanas de idade foram distribuídas em 5 grupos: PBS; 40 μg de rgD + PBS; BoHV5 inativado + 50% v/v w/o (90% Marcol 52 + 10% Montanide 888); BoHV-5 inativado + 50% v/v w/o + 40 μg rgD e 50% v/v w/o + 40 μg rgD. Três doses foram administradas e o soro obtido em intervalos de 2 semanas até o dia 42. Esplenócitos foram coletados no dia 42 para avaliação da resposta celular através de Real-time PCR. Foi realizada, até o momento, a avaliação da resposta imune humoral através de ELISA Indireto e soroneutralização viral. Em bovinos, 36 animais foram distribuídos em 4 grupos: BoHV5 inativado + 50% v/v w/o; BoHV-5 inativado + 50% v/v w/o + 40 μg rgD; 50% v/v w/o + 40 μg rgD e 40 μg rgD + Al(OH)3. Estes animais foram imunizados 2 vezes em intervalo de 14 dias e acompanhados até 180 dias após a primeira imunização. A resposta imune humoral foi avaliada, até o momento, por ELISA Indireto. Apesar da expressão da rgD ter sido obtida em bioreatores, etapas downstream ainda necessitam de aperfeiçoamento e equipamentos que permitam a concentração da proteína em volumes acima de 1l. A rgD administrada em camundongos sugere estrutura tridimensional compatível com a gD nativa, uma vez que induziu a formação de anticorpos neutralizantes. Em bovinos, houve indução de resposta humoral contra a rgD. Desta forma, novos experimentos deverão ser em breve conduzidos, como a finalização da avaliação das respostas humorais e celulares nas duas espécies estudadas, bem como a repetição dos experimentos realizados em bovinos, visando confirmar os resultados obtidos até o momento.
Luana Alves Dummer
Prof. Orientador: Dr. Fábio Pereira Leivas Leite
A meningoencefalite causada pelo Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é responsável por perdas econômicas de pecuaristas na América do Sul. A glicoproteína D (gD) é uma das glicoproteínas que mediam a infecção e é o maior alvo para a produção de anticorpos neutralizantes, o quais podem reduzir a replicação viral. A gD do BoHV-5 possui aproximadamente 417 amino ácidos, sítios de N e O-glicosilação e seis resíduos de cisteínas conservadas, sugerindo pontes dissulfídicas. A clonagem da gD de BoHV-5 foi realizada em Pichia pastoris cepa KM71H MutS através do vetor pPICZαB. Após caracterização da rgD, foram realizados experimentos visando a otimização da expressão desta proteína recombinante em bioreatores e avaliação da imunogenicidade da rgD em camundongos e bovinos. A expressão da rgD em bioreatores foi realizada em meios Fermentation Medium (FM) ou BMMY, induzidos com 1% de metanol com taxa de oxigênio dissolvido mantida estável a 30% durante o período de indução. Para a imunização de camundongos, 25 fêmeas entre 6-9 semanas de idade foram distribuídas em 5 grupos: PBS; 40 μg de rgD + PBS; BoHV5 inativado + 50% v/v w/o (90% Marcol 52 + 10% Montanide 888); BoHV-5 inativado + 50% v/v w/o + 40 μg rgD e 50% v/v w/o + 40 μg rgD. Três doses foram administradas e o soro obtido em intervalos de 2 semanas até o dia 42. Esplenócitos foram coletados no dia 42 para avaliação da resposta celular através de Real-time PCR. Foi realizada, até o momento, a avaliação da resposta imune humoral através de ELISA Indireto e soroneutralização viral. Em bovinos, 36 animais foram distribuídos em 4 grupos: BoHV5 inativado + 50% v/v w/o; BoHV-5 inativado + 50% v/v w/o + 40 μg rgD; 50% v/v w/o + 40 μg rgD e 40 μg rgD + Al(OH)3. Estes animais foram imunizados 2 vezes em intervalo de 14 dias e acompanhados até 180 dias após a primeira imunização. A resposta imune humoral foi avaliada, até o momento, por ELISA Indireto. Apesar da expressão da rgD ter sido obtida em bioreatores, etapas downstream ainda necessitam de aperfeiçoamento e equipamentos que permitam a concentração da proteína em volumes acima de 1l. A rgD administrada em camundongos sugere estrutura tridimensional compatível com a gD nativa, uma vez que induziu a formação de anticorpos neutralizantes. Em bovinos, houve indução de resposta humoral contra a rgD. Desta forma, novos experimentos deverão ser em breve conduzidos, como a finalização da avaliação das respostas humorais e celulares nas duas espécies estudadas, bem como a repetição dos experimentos realizados em bovinos, visando confirmar os resultados obtidos até o momento.